GlycanDIA工作流的开发与应用：糖组学分析的高灵敏度精准检测新方法

本研究针对传统糖组学方法在低丰度糖链检测和定量精度上的局限性，开发了基于数据非依赖采集(DIA)的GlycanDIA工作流，结合高能碰撞解离(HCD)-MS/MS和交错窗口技术，显著提升N-糖、O-糖和母乳寡糖(HMOs)的鉴定灵敏度与定量准确性。通过自主研发的GlycanDIA Finder搜索引擎，成功解析了糖基化RNA中组织特异性N-糖谱，为糖生物学研究提供了革新性工具。

　　

糖分子作为细胞"糖萼"的关键组分，通过修饰蛋白质、脂质甚至RNA参与细胞信号传导、免疫应答等生理过程。然而，传统核磁共振(NMR)和凝集素芯片技术面临样本需求量大、缺乏序列信息的瓶颈，而依赖数据依赖采集(DDA)的质谱方法又因丰度依赖性导致低丰度糖链漏检。尤其在新发现的糖基化RNA(glycoRNA)研究中，其糖链丰度仅为20 pmol/μg RNA，亟需高灵敏度分析方法突破技术壁垒。

针对这一挑战，加州大学戴维斯分校(University of California, Davis)的研究团队开发了GlycanDIA工作流。该系统通过优化24 m/z交错窗口的DIA参数和20%归一化碰撞能量(NCE)的HCD碎裂条件，结合多孔石墨化碳(PGC)色谱分离，实现了对500-2000 m/z范围内糖链的全覆盖检测。配套开发的GlycanDIA Finder搜索引擎采用迭代诱饵搜索算法，将鉴定假阳性率控制在2%以下。研究证明该方法在标准糖蛋白样本中鉴定数较DDA提高25%，定量变异系数(CV)低于5%，并能区分包括Man8异构体在内的复杂糖链结构。

关键技术包括：(1)建立基于Orbitrap Exploris 240质谱的DIA-HCD分析方法；(2)开发支持修饰糖链分析的GlycanDIA Finder软件；(3)应用PGC色谱分离糖链异构体；(4)采用HEK293T、HeLa细胞系及小鼠组织样本验证技术普适性；(5)通过同位素标记标准品评估定量性能。

Development and application of GlycanDIA workflow for glycomic analysis

研究团队首先验证了GlycanDIA在复杂糖链分析中的优势。在RNase B和血清糖蛋白混合样本中，该方法鉴定出270种N-糖（含异构体），较DDA多出70种。通过三组同位素标记标准品的重复实验显示，GlycanDIA在10次重复中100%检出目标糖链，而DDA漏检率达60%。碎片离子定量分析表明，大分子碎片离子（如1258.45 m/z）具有更优的线性范围（R²>0.99）和更低的基质效应。

Compositional and structural glycan isomers can be determined using GlycanDIA

在牛血清样本中，研究者通过1120.90 m/z母离子的精确提取，成功区分了Hex(6)HexNAc(4)Fuc(1)Neu5Ac(1)与Hex(5)HexNAc(4)Fuc(2)Neu5Gc(1)两种同量异位素糖链。对于母乳寡糖，该方法通过325.11/343.12 m/z碎片比例差异实现了2'-岩藻糖基乳糖(2'FL)与3-岩藻糖基乳糖(3FL)的鉴别。在唾液酸连接方式分析中，α2,3-连接糖链显示更强的292.10 m/z碎片信号，而α2,6-连接体则产生更多1055.37 m/z天线碎片。

Revealing the landscape of N-glycans from RNA extracts

应用该技术解析glycoRNA糖谱发现：HEK293T细胞中76种糖链与糖蛋白重叠，但唾液酸化岩藻糖基化糖链(sialofucosylated glycans)在RNA上富集度达47%，显著高于糖蛋白的29%。在岩藻糖合成缺陷型HCT116细胞中，外源添加100 mM岩藻糖可使Hex(7)HexNAc(6)Neu5Ac(1)转化为Hex(7)HexNAc(6)Fuc(1)Neu5Ac(1)的比例提升90%，证实糖基转移酶对RNA与蛋白质底物的共同修饰能力。小鼠组织分析显示脑组织75%为岩藻糖基化糖链，而心脏组织高甘露糖型占比达30%，结肠组织则特异性富集四天线Hex(7)HexNAc(7)结构。

这项发表于《Nature Communications》的研究建立了首个DIA-based糖组学全流程解决方案，其创新性体现在三方面：技术层面突破低丰度糖链检测极限，方法学上实现DIA技术在游离糖链分析的首次应用，生物学层面揭示glycoRNA具有区别于糖蛋白的特异性糖谱。该工作流为疾病相关糖基化修饰研究、糖类生物标志物发现提供了强大工具，特别是为探索glycoRNA在Siglec受体介导的免疫调控中的作用开辟了新途径。未来通过整合离子淌度分离和电子激活解离(EAD)技术，有望进一步解析糖链精细结构。