"一锅法"UDGase辅助多指标纳米生物传感器检测平台的构建及其在布鲁氏菌种间鉴别中的应用

研究人员针对布鲁氏菌病诊断中Brucella melitensis(B. melitensis)鉴别难题，开发了整合uracil-DNA-glycosylase(UDGase)与金纳米颗粒侧流层析(AuNPs-LFA)的多重交叉置换扩增(mMCUDA)检测平台。该技术可在65℃ 60分钟内实现7.5 fg/反应的超高灵敏度检测，特异性区分B. melitensis与其他布鲁氏菌种，并能有效消除气溶胶污染(1.5×10-13 g/反应)，为临床提供了一种简便、快速的一体化诊断方案。

　　

布鲁氏菌病作为全球范围内重要的人畜共患病，每年导致约50万新增病例，其中Brucella melitensis(B. melitensis)被认为是最具致病性的菌种。然而传统诊断方法面临巨大挑战：细菌培养需3-4天且阳性率低，血清学检测存在交叉反应，而PCR技术又依赖昂贵仪器。更棘手的是，现有方法难以在种水平上区分高致病性的B. melitensis与其他布鲁氏菌，这给精准诊疗和疫情防控带来严峻考验。

针对这一系列难题，贵州省疾病预防控制中心的研究团队在《BMC Microbiology》发表创新性研究，开发出集核酸扩增、种属鉴别和污染控制于一体的mMCUDA检测平台。该技术通过巧妙整合多重交叉置换扩增(MCDA)、金纳米颗粒侧流层析(AuNPs-LFA)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDGase)系统，成功实现了布鲁氏菌属通用检测与B. melitensis特异性鉴别的双重目标。研究证实该平台具有操作简便(一锅法完成)、灵敏度高(7.5 fg/反应)、抗污染能力强等优势，为基层医疗机构提供了理想的现场检测工具。

关键技术方法包括：1)针对bcsp31(属特异性)和BMEII0466(种特异性)基因设计两套MCDA引物；2)开发可同时检测FAM/Dig标记的双指标AuNPs-LFA生物传感器；3)采用dUTP完全替代dTTP的UDGase防污染体系；4)使用44株临床分离株和54份全血样本进行验证。

研究结果：

背景与目标

强调B. melitensis在布鲁氏菌病流行中的主导地位，指出现有诊断技术无法满足快速、特异检测的需求，提出开发整合污染控制的多靶标检测平台的必要性。

方法优化

通过温度梯度实验确定65℃为最佳反应温度，引物比例优化实验证实BMEII0466引物组占比46%时可实现均衡扩增。UDGase系统可消除1.5×10^-13 g/反应的污染风险，较同类技术提高2-5个数量级。

分析性能

检测限达7.5 fg/反应，能准确区分B. melitensis与B. abortus等近缘种，对37种病原体的特异性达100%。双靶标检测效率与单靶标相当，且不受UDGase酶影响。

临床应用

44株临床分离株鉴定结果与初始分型完全一致，54份全血样本检测结果与培养法和实时PCR完全吻合，证实其在复杂临床样本中的可靠性。

这项研究的突破性在于：首次将布鲁氏菌属检测与B. melitensis鉴别整合至单管反应体系，通过创新的多指标AuNPs-LFA生物传感器实现可视化判读，配合UDGase系统有效解决了等温扩增技术的气溶胶污染难题。该技术不仅将检测时间缩短至1小时，其7.5 fg的灵敏度更优于常规PCR方法，为偏远地区布鲁氏菌病的早期诊断和疫情监控提供了强有力的技术支撑。特别值得注意的是，研究中完全用dUTP替代dTTP的设计策略，使污染控制能力达到1.5×10^-13 g/反应的行业领先水平，这一创新为其他核酸快检技术的开发提供了重要参考。