基于RPA-CRISPR/Cas12a的杰克贝尔氏粉蚧 可视化快速检测体系建立

　　

摘要： 【目的】本研究旨在利用重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)-CRISPR/Cas12a技术建立一套对杰克贝尔氏粉蚧Pseudococcus jackbeardsleyi进行快速、灵敏、便捷和可视化的荧光检测和侧向流层析检测(lateral flow assay)体系，以实现在田间或者口岸等资源受限场所的现场实时检测。【方法】基于杰克贝尔氏粉蚧28S rDNA基因序列设计RPA特异性引物和crRNA，分别对杰克贝尔氏粉蚧与其他9种粉蚧(木瓜秀粉蚧Paracoccus marginatus、石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani、扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis、柑橘臀纹粉蚧Planococcus citri、南洋臀纹粉蚧Planococcus lilacinus、新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes、大洋臀纹粉蚧Planococcus minor、柑橘棘粉蚧Pseudococcus cryptus和奥德曼粉蚧Pseudococcus odermatti)进行RPA和CRISPR/Cas12a检测，验证该体系的特异性。对RPA-CRISPR/Cas12a检测体系进行条件优化，包括RPA反应时间、Cas12a和crRNA的浓度比及其浓度、荧光报告分子FQ Reporter的浓度、试纸条报告分子LF Reporter的浓度以及CRISPR/Cas12a体系反应时间，筛选获得最佳检测体系。【结果】利用设计的RPA特异性引物的RPA体系可扩增出一条201 bp的杰克贝尔氏粉蚧28S rDNA基因片段，结合CRISPR/Cas12a反应体系，可特异性地将杰克贝尔氏粉蚧与其他9种粉蚧区分开，并呈现可视化结果。通过条件优化建立的对杰克贝尔氏粉蚧的最适RPA-CRISPR/Cas12a检测体系中，RPA反应时间为20 min，Cas12a和crRNA浓度比为1∶1且在体系中的浓度均为50 nmol/L，LF Reporter浓度为500 nmol/L， LF Reporter浓度为800 nmol/L，荧光检测体系和侧向流层析检测体系的反应时间分别为5和20 min。【结论】本研究建立了一套杰克贝尔氏粉蚧RPA-CRISPR/Cas12a检测体系，具有高特异性、快速(25~40 min)、不依赖仪器设备且结果可视化的优点。该检测体系在入侵粉蚧的早期识别和现场检测具有重要的应用价值，为制定合理的管理策略提供了指导。