纳米载体SPc提升橘小实蝇中的RNA干扰效率

　　

摘要： 【目的】提供一种用于提高橘小实蝇Bactrocera dorsalis中的RNA干扰(RNA interference, RNAi)效率和双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)稳定性的纳米复合物及其制备方法与应用手段。【方法】采用琼脂糖凝胶阻滞实验(agarose gel shifting test)检测橘小实蝇成虫血淋巴对dseGFP的降解能力，星形阳离子聚合物 (star polycation, SPc)与dseGFP结合的最佳质量比，以及SPc对dseGFP的保护作用。通过向橘小实蝇成虫腹部注射常用于dsRNA递送体系的表面活性剂烷基糖苷(alkyl polyglucoside, APG)，计算死亡率，评估其毒性。在体外合成的dshsp68与纳米载体SPc混合后，用显微注射的方法将纳米复合物注射入橘小实蝇成虫的腹部，运用RT-qPCR检测RNAi效率。【结果】琼脂糖凝胶电泳结果显示橘小实蝇血淋巴能迅速降解dseGFP，当SPc与dseGFP的质量比大于或等于1∶1时能自发形成SPc/dseGFP纳米复合物，减缓橘小实蝇血淋巴对dseGFP的降解。表面活性剂APG对橘小实蝇成虫毒性较强，注射APG后48 h时橘小实蝇的平均死亡率为78.33%，不适宜作为注射法的助剂。单独注射dshsp68后48 h时的RNAi效率为49.53%，在72 h时失去RNAi效果，而注射SPc/dshsp68纳米复合物的RNAi效率更高，48 h时达到了85.99%，且在72 h时的RNAi效率为40.87%，具有更长的RNAi持效时间。【结论】 SPc可以结合dsRNA形成复合物，减缓dsRNA被橘小实蝇血淋巴RNase的降解，从而实现持续高效的RNAi敲降效果。本研究建立了一种通过纳米载体SPc实现高效RNAi的方法，可以用于橘小实蝇基因功能研究。