T5核酸外切酶融合的CRISPR-Cas12f系统exoCasMINI：基因编辑效率提升与肿瘤模型构建新工具

本研究针对CRISPR-Cas12f系统编辑效率低下的瓶颈问题，通过将T5核酸外切酶与微型核酸酶CasMINI融合，成功开发出exoCasMINI系统。该工具在保持高特异性的同时，编辑效率提升1.1-21.1倍，可诱导更长片段缺失，并在小鼠肝脏肿瘤模型中展现出优于传统SpCas9的基因治疗潜力，为AAV递送系统的临床应用提供了新选择。

　　

基因编辑技术近年来在生物医学领域掀起革命浪潮，其中CRISPR-Cas系统因其精准的"分子剪刀"特性备受瞩目。然而主流核酸酶SpCas9和LbCas12a庞大的蛋白尺寸（分别超过1300和1200个氨基酸）成为AAV载体递送的"阿喀琉斯之踵"。虽然微型Cas12f蛋白（仅400-500个氨基酸）能解决递送难题，但其编辑效率低下严重制约临床应用。这一矛盾成为制约基因治疗发展的关键瓶颈。

南方医科大学基础医学院肿瘤研究所的研究团队独辟蹊径，创新性地将噬菌体来源的T5核酸外切酶（T5 exonuclease）与工程化微型核酸酶CasMINI融合，开发出exoCasMINI系统。这项发表于《iScience》的研究显示，该工具不仅保持原始系统的高特异性，更将编辑效率提升至与传统核酸酶相当的水平，并在小鼠肝脏肿瘤模型中展现出显著优势。

研究团队采用多学科交叉的技术路线：通过蛋白质工程构建T5-CasMINI融合系统；利用深度测序（Deep-seq）和标签测序（Tag-seq）评估编辑效率和特异性；建立小鼠肝脏肿瘤模型验证体内编辑效果；通过Western blotting检测蛋白表达水平。这些方法系统性地解析了exoCasMINI的性能特征。

融合T5核酸外切酶显著提升编辑效率

研究首先筛选多种核酸酶融合策略，发现T5外切酶（无论连接在N端或C端）均能使KLHL29和NLRC4位点的编辑效率提升2.1-10.7倍。关键突变实验证实，T5的DNA结合位点K196和催化位点K83共同决定活性增强效果。Western blotting排除了蛋白表达量差异的干扰，证明效率提升源于T5的功能整合。

exoCasMINI兼具高效与高特异性

在16个基因组位点测试中，exoCasMINI在15个位点展现显著优势，尤其在低效位点如FGF18和VEGFA实现6.5-21倍提升。Tag-seq分析显示其特异性指数（Specificity Index）达0.82，与CasMINI（0.87）相当，远优于SpCas9（0.55）。值得注意的是，该系统诱导的缺失片段更长（>10bp），这归因于T5外切酶的DNA末端修剪功能。

肿瘤模型验证治疗潜力

在C57BL/6小鼠肝脏肿瘤模型中，exoCasMINI组肝脏表面肿瘤结节数（3.8个）显著多于CasMINI组（0.8个），肝脏重量增加64%。组织学分析显示典型的胆管细胞癌特征，基因测序证实成功引入致癌突变Kras^G12D并破坏抑癌基因Trp53/Pten。

横向比较展现系统优势

与SpCas9和LbCas12a相比，exoCasMINI（529aa）在多个位点达到相当编辑效率，同时保持Cas12f家族的小尺寸优势。在共享靶点的特异性测试中，其特异性指数（0.81）接近LbCas12a（0.92），显著优于SpCas9（0.55）。

技术普适性验证

研究还将该策略拓展至RhCas12f1系统，构建的exoRhCas12f1同样实现效率提升，证实T5融合策略的广泛适用性。

这项研究突破了微型CRISPR系统效率低下的技术瓶颈，exoCasMINI系统兼具AAV友好尺寸（<500aa）与传统核酸酶效率的双重优势。特别值得注意的是，其诱导的长片段缺失特性为基因敲除和基因替换提供了新可能。在安全性方面，虽然Tag-seq显示特异性保持良好，但研究者也指出需警惕外切酶可能带来的脱靶风险，这为后续优化指明了方向。

从转化医学角度看，该研究首次在成年哺乳动物模型中验证了微型CRISPR系统的肿瘤建模能力，为癌症机制研究和基因治疗提供了重要工具。尤其值得关注的是，exoCasMINI系统与AAV递送的兼容性，使其在遗传病、肿瘤免疫治疗等领域具有广阔应用前景。正如研究者强调，通过进一步优化外切酶模块（如减小尺寸、提高活性），这一技术平台有望成为下一代基因治疗的核心引擎。