利用酵母双杂交系统筛选SARS-CoV-2奥密克戎变异株核衣壳蛋白与宿主因子的互作网络及其抗病毒机制研究

本研究针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白（N蛋白）在病毒感染中的关键作用，通过酵母双杂交技术从人外周血单核细胞（PBMCs）中筛选出11个潜在互作宿主蛋白，重点验证了RNF2和ARL15通过结合N蛋白抑制冠状病毒复制的机制。研究揭示了N蛋白通过下调宿主抗病毒因子逃逸免疫的新策略，为广谱抗冠状病毒药物开发提供了新靶点。

　　

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的核衣壳蛋白（N蛋白）作为病毒颗粒中最丰富的结构蛋白，在病毒复制、转录和免疫逃逸中发挥核心作用。尽管N蛋白在冠状病毒进化中高度保守，但其与宿主因子的互作网络仍存在大量未知领域。尤其值得注意的是，奥密克戎变异株的出现对现有疫苗效力提出挑战，而靶向N蛋白的抗病毒策略因其保守性更具广谱应用潜力。襄阳市中心医院附属湖北文理学院中心实验室的研究团队在《BMC Microbiology》发表的研究，通过创新性地采用人外周血单核细胞（PBMCs）cDNA文库，突破了既往基于细胞系的筛选局限，为揭示天然免疫相关宿主防御机制提供了新视角。

研究采用酵母双杂交系统（Y2H）筛选技术，结合免疫共沉淀（Co-IP）、免疫荧光共定位和分子对接等实验方法，从50mL健康志愿者血液分离的PBMCs中构建了1.2×10⁷ CFU规模的cDNA文库。通过系列验证实验发现，SARS-CoV-2和HCoV-OC43的N蛋白均能特异性结合宿主E3泛素连接酶RNF2和小GTP酶ARL15，分子对接显示结合自由能分别达-14.3 kcal/mol和-19.4 kcal/mol。关键的是，临床样本分析显示COVID-19患者血液中RNF2和ARL15表达显著下调，而体外实验证实过表达这两个蛋白可使HCoV-OC43病毒载量降低10倍以上。

主要研究结果

1. 酵母双杂交筛选鉴定：从PBMCs文库中鉴定出11个新型N蛋白互作宿主因子，包括RNF2（6个克隆）、ARL15（5个克隆）等，这些蛋白在核糖体生物发生、抗原提呈和JAK-STAT通路中富集。
   

   

2. 互作机制验证：Co-IP证实N蛋白与RNF2/ARL15存在物理结合，免疫荧光显示其在胞质共定位。分子对接揭示N蛋白Tyr-333、Asp-341等残基与RNF2形成氢键网络。
   

   

3. 抗病毒功能解析：HCoV-OC43感染动态下调RNF2/ARL15表达，siRNA敲低使病毒载量增加3-5倍，而过表达则显著抑制病毒复制，提示其具有天然抗冠状病毒活性。

4. 临床相关性：COVID-19患者外周血中RNF2和ARL15 mRNA水平较健康对照降低60%-70%，与体外实验结果相互印证。

研究意义
该研究首次系统描绘了SARS-CoV-2 N蛋白与天然免疫细胞的互作图谱，发现RNF2和ARL15作为新型宿主限制因子可通过直接结合N蛋白抑制冠状病毒复制。这不仅深化了对病毒免疫逃逸机制的理解，更重要的是为开发靶向N蛋白-宿主互作界面的广谱抗冠状病毒药物提供了理论依据。特别是RNF2作为E3泛素连接酶，其介导的蛋白降解通路可能成为新的药物设计靶点。研究采用的PBMCs筛选策略也为探索其他病毒-宿主互作提供了方法学参考。未来需要进一步在动物模型中验证这些宿主因子的治疗潜力，并探索其在不同冠状病毒中的保守性。