毛细管电泳法检测杜氏肌营养不良患者及动物模型中白蛋白硫醇氧化的新方法及其生物标志物价值

为解决炎症相关疾病中氧化应激生物标志物检测的技术瓶颈，Angelo Patrick R. Bautista等研究人员开发了一种基于毛细管电泳（CE-AlbOx）的白蛋白硫醇氧化（AlbOx）检测方法。该技术仅需10μL样本，17分钟即可完成分析，首次实现小鼠白蛋白双硫醇氧化的定量，并在杜氏肌营养不良（DMD）患者和动物模型中验证了其作为慢性炎症标志物的敏感性。研究为氧化应激监测提供了高效工具，发表于《Metabolism》。

　　

在慢性炎症性疾病如杜氏肌营养不良（DMD）中，氧化应激是加速组织损伤的关键因素。白蛋白作为血浆中最丰富的蛋白质，其第34位半胱氨酸（Cys₃₄）的硫醇基团对氧化修饰高度敏感，可能成为反映全身氧化应激水平的"分子传感器"。然而，现有检测技术如高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）存在耗时长、分辨率低或设备门槛高等局限，尤其缺乏适用于小鼠模型的可靠方法——这一问题直接阻碍了临床前研究的转化价值。

西澳大利亚大学分子科学学院（School of Molecular Sciences, University of Western Australia）的研究团队创新性地将毛细管电泳（CE）与聚乙二醇马来酰亚胺（mPEG）标记技术结合，开发出CE-AlbOx方法。该技术通过mPEG标记还原态白蛋白硫醇，利用十二烷基硫酸钠（SDS）胶束电动色谱分离氧化/还原形式，仅需17分钟即可同时检测可逆氧化（如二硫键加合物）、不可逆氧化（如磺酸基团）状态。研究首次发现小鼠白蛋白存在第二个活性硫醇位点Cys₅₇₉，并证实DMD患者和动物模型（mdx小鼠、大鼠）的氧化白蛋白水平显著升高，与中性粒细胞活化产生的次氯酸（HOCl）和牛磺酸氯胺（TauCl）直接相关。

关键技术方法

研究优化了mPEG标记浓度（3mM mPEG1/15mM mPEG2）和电泳条件（45mM磷酸盐缓冲液含2.5% SDS），通过质谱鉴定了小鼠白蛋白Cys₅₇₉位点。采用人源DMD患者血浆（英国纽卡斯尔生物样本库）和三种动物模型（22日龄mdx小鼠、1.5月龄mdx大鼠），比较了CE与SDS-PAGE的检测效能，并通过体外实验验证了中性粒细胞氧化剂（50μM HOCl/TauCl）对白蛋白的修饰作用。

研究结果

1. 方法优化

   CE-AlbOx的日内/日间变异系数<2%，线性范围0.016-0.50mg/ml，较SDS-PAGE显著提高不可逆氧化检测灵敏度（Bland-Altmann分析偏差仅-0.43%）。

2. 小鼠白蛋白双硫醇特性

   质谱在肽段E.GPNLVTRC₅₇₉KDALA中检测到乙基马来酰胺加合物，证实Cys₅₇₉的活性。mdx小鼠完全氧化白蛋白（双硫醇氧化）比例较野生型升高2.92%，提示该位点可能增强抗氧化缓冲能力。

3. 疾病模型验证

   DMD患者可逆氧化白蛋白增加8.95%（p<0.05），而动物模型同时表现可逆/不可逆氧化升高（mdx大鼠不可逆氧化增加1.78%）。中性粒细胞活化实验显示TauCl诱导的可逆氧化增幅达15.39%，显著高于HOCl（5.67%）。

结论与意义

该研究突破性地建立了跨物种适用的白蛋白氧化检测标准，其核心价值体现在三方面：首先，CE-AlbOx的高通量特性（每日可分析>80样本）使其适合临床筛查；其次，发现小鼠白蛋白独特的双硫醇系统为解释mdx模型较温和的表型提供了新视角——额外的Cys₅₇₉可能通过"硫醇缓冲池"效应减轻氧化损伤；最后，证实TauCl是炎症环境下白蛋白氧化的主要介质，为靶向干预提供了明确靶点。这些发现将推动氧化应激监测从实验室走向临床应用，尤其对DMD等慢性炎症疾病的疗效评估具有转化意义。