CRISPR/Cas9基因组编辑解锁酿造酵母风味潜力：靶向CAR1基因增强水果与花香物质合成

为解决传统酵母工程方法效率低且难以精准调控风味物质合成的问题，研究人员通过CRISPR/Cas9技术靶向敲除CAR1基因，发现该操作能显著提升酵母菌株中异戊醇（热带水果香）和苯乙醇（花香）产量，且该效应具有菌株普适性。研究为食品饮料行业的风味精准调控提供了新策略，同时揭示了氮代谢与挥发性风味物质合成的新调控节点。

　　

在啤酒、清酒等发酵饮品中，酵母代谢产生的风味物质直接决定了产品的感官品质。传统方法依赖随机诱变或异源基因导入来改造酵母，但前者效率低下，后者常面临严格的转基因监管限制。更棘手的是，当前对酵母天然风味合成网络的认知仍存在空白，尤其是氮代谢如何影响水果香（如异戊醇）和花香（如苯乙醇）等关键物质的合成尚不明确。与此同时，酿造过程中产生的氨基甲酸乙酯（EC）具有致癌性，其前体尿素正是由精氨酸酶（CAR1编码）催化生成——这使CAR1成为食品安全与风味调控的双重潜在靶点。

首尔大学国际农业技术研究生院的研究团队在《LWT》发表的研究中，利用CRISPR/Cas9系统对三株遗传背景不同的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行CAR1基因编辑，构建了完全缺失型（ΔCAR1）和提前终止密码子型（Gln26stop）突变体。通过HS-SPME-Arrow-GC/MS分析挥发性物质，结合生长曲线和乙醇产量测定，系统评估了基因编辑对风味谱和发酵性能的影响。关键技术包括：1）体外转录sgRNA与质粒表达Cas9的递送系统；2）基于CAO培养基（含刀豆氨酸）的突变体筛选；3）MseI酶切和测序验证编辑准确性；4）多菌株平行实验验证普适性。

3.1 S. cerevisiae KCCM 51299 ΔCAR1和Gln26stop突变体风味分析

全基因组测序结合GC-MS发现，两种CAR1突变体均显著提升异戊醇（+29.8%）和苯乙醇（+79.5%），但中链脂肪酸及其乙酯（如己酸乙酯）合成减少。这表明CAR1失活可能通过氮代谢重编程，将碳流导向支链氨基酸降解的Ehrlich途径。

3.3 CRISPR/Cas9编辑突变体的筛选与鉴定

通过PCR产物大小差异（ΔCAR1产生1 kb片段，野生型为2 kb）和MseI酶切（Gln26stop引入TTAA位点）实现双重验证。CAO培养基筛选证明所有突变体均丧失精氨酸酶活性。

3.5 野生型与编辑菌株的发酵性能

三株酵母的ΔCAR1和Gln26stop突变体在生长速率、葡萄糖消耗和乙醇产量上与野生型无显著差异，表明风味增强未牺牲基础发酵能力。

3.6 风味物质的GC-MS分析

SNUws菌株中异戊醇从243.04 mg/L增至315.52 mg/L（ΔCAR1）和312.95 mg/L（Gln26stop）；苯乙醇从40.58 mg/L最高提升至72.82 mg/L。KCCM 51299和SNUit菌株也呈现相似趋势，证实该现象的菌株独立性。

这项研究首次揭示CAR1失活与风味物质合成的关联：精氨酸代谢受阻可能通过增加支链氨基酸（如亮氨酸）和芳香族氨基酸（如苯丙氨酸）的降解，促进其对应高级醇的生成。该方法不仅规避了转基因法规限制（仅需单基因编辑），还同步降低了致癌物EC的风险。研究为酿造工业提供了可定制化风味谱的通用技术框架，未来可通过整合动态调控策略进一步优化风味强度与平衡性。值得注意的是，脂肪酸衍生风味物质的减少提示CAR1可能参与碳氮代谢全局调控，这为理解酵母次级代谢网络提供了新视角。