肽接头插入铰链区实现抗TNFR2双特异性抗体从激动剂到拮抗剂的功能转换

为解决肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）靶向治疗中激动/拮抗功能调控的难题，京都大学团队通过铰链区插入GP等肽接头，成功将激动型双特异性抗体（BpAb）转化为拮抗剂。研究结合冷冻电镜（cryo-EM）和粗粒化分子动力学（CGMD）模拟，揭示表位组合与1:1免疫复合物稳定性的关联，为TNFRSF家族药物的理性设计提供新策略。

　　

肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）成员TNFR₂是免疫调控和癌症治疗的热门靶点，但其功能调控存在矛盾：激动剂可促进免疫细胞激活，而拮抗剂则能抑制免疫抑制性T细胞。传统IgG抗体因1:2复合物形成的固有特性，难以实现精准调控。更棘手的是，双特异性抗体（Biparatopic antibodies, BpAbs）虽能通过结合不同表位形成多样化免疫复合物，但如何定向控制复合物大小（如1:1或交联簇）仍是未解难题。

京都大学大学院药学研究生院的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》发表的研究中，提出了一种革命性解决方案：通过铰链区插入肽接头，直接调控BpAb的空间构象。研究人员选取两种靶向TNFR₂的激动型BpAb（BA1和BA2），分别插入GP、Pro10等不同长度肽接头。令人振奋的是，BA1-GP4/GP8通过形成稳定的1:1复合物，完全丧失激动活性并转化为高效拮抗剂，而BA2即使插入最长接头仍保留部分激动功能。这种表位依赖性差异通过冷冻电镜解析的1:1复合物结构得到解释——BA1中92-Fab与96-Fab结合于TNFR₂长轴同侧，而BA2的109-Fab与96-Fab则分布于不同轴向位置。粗粒化分子动力学模拟进一步显示，后者会导致TNFR₂结构扭曲，促使复合物向交联态转化。

关键技术方法

研究采用CrossMab格式构建BpAb，通过SEC和CIEX纯化；采用报告基因法检测NF-κB信号活性；SEC和质谱光散射（Mass photometry）分析复合物尺寸；冷冻电镜解析BA1-GP4-TNFR₂复合物结构（分辨率3.73?）；CafeMol软件进行粗粒化分子动力学模拟。

研究结果

1. 肽接头插入对生物活性的影响

   GP接头延长至4/8单元时，BA1最大激动活性下降80%并显现拮抗效应，而BA2仅活性减半。质量光散射证实BA1-GP4以1:1复合物为主（190 kDa），BA2-GP4则仍存在2:2复合物（390 kDa）。

2. 1:1复合物的结构基础

   冷冻电镜显示BA1-GP4中两个Fab分别结合TNFR₂的CRD2/CRD3，C端间距达15nm，需44nm长GP接头才能稳定连接。表位分析发现92-Fab结合界面与既往结构一致，但96-Fab新表位位于CRD1远端。

3. 分子动力学揭示表位选择规律

   PCA分析表明，BA2-GP4会引起TNFR₂的N端剧烈摆动（PC1贡献65.7%），而BA1-GP4因表位同轴分布更稳定。这解释了为何BA2难以通过单纯延长接头实现完全拮抗。

结论与意义

该研究首次证明通过铰链区工程可定向调控BpAb功能，突破传统IgG结构的空间限制。提出的"表位同轴稳定"原则（图6d）为设计TNFRSF靶向药物提供新范式：除传统同侧表位组合外，反向表位对配合长接头也能实现1:1结合。尽管GP接头的糖基化修饰影响稳定性的问题待优化，但该策略可扩展至其他膜受体调控，为癌症免疫治疗提供精准工具。