SCoTCH-seq技术揭示5-羟甲基胞嘧啶（hmC）在DNA双链中的跨链调控信息编码机制

这篇研究通过创新性SCoTCH-seq技术，首次实现小鼠胚胎干细胞（mESC）基因组中胞嘧啶（C）、5-甲基胞嘧啶（mC）和5-羟甲基胞嘧啶（hmC）在DNA双链上的同步定量检测。研究发现hmC主要呈现不对称分布（98%），形成HC/CH和HM/MH两种跨链组合，在增强子（primed enhancer）和基因体（gene body）中具有独特分布模式，并与转录活性显著相关。该成果为表观遗传调控机制提供了双链维度的新见解。

　　

定量同步测序DNA双链中的C、mC和hmC

哺乳动物基因组中，胞嘧啶修饰（C/mC/hmC）构成独立于遗传密码的表观调控层。传统测序技术无法同时解析DNA双链上这三种修饰的分布。本研究开发的SCoTCH-seq技术通过发夹接头（hairpin adapter）物理连接DNA双链，经Klenow exo-聚合酶延伸生成拷贝链，结合DNMT5甲基转移酶和TET2氧化/葡萄糖基化保护步骤，最终实现单碱基分辨率下九种CpG状态（如CC、MM、HC等）的定量检测。技术验证显示所有状态检测准确率>94%，覆盖小鼠基因组94.4%区域。

hmC在mESC中呈现全形式分布且高度不对称

全局分析显示，mESC中60% CpG位点为对称甲基化（MM），22%为未修饰（CC），而hmC仅占6%。其中98%的hmC呈不对称分布：HC/CH（hmC与未修饰C配对）占3.6%，HM/MH（hmC与mC配对）占2%，对称羟甲基化（HH）仅0.1%。这种分布模式暗示hmC的维持机制不同于mC的"半保留复制"模型，其跨链组合可能通过空间构象差异（如大沟区7?间距）被MeCP2、UHRF1等阅读蛋白特异性识别。

启动增强子以HC/CH高表达为特征

基于增强子分类体系的分析发现，primed enhancer中hmC水平显著高于活性/静息增强子，且HC/CH在增强子中心区域富集，而HM/MH仅轻微增加。有趣的是，尽管primed enhancer富含hmC，Tet三敲除（TKO）实验表明这些位点去甲基化活性较低，提示hmC在此可能具有独立于去甲基化的功能。活性/静息增强子则呈现中心区hmC缺失、侧翼区HC/CH升高的独特模式。

HC/CH状态标记转录活跃基因

基因体分析揭示HC/CH与转录活性呈最强正相关（Spearman's ρ=0.38），其水平在转录起始位点（TSS）最低，而在转录终止位点（TTS）下游最高。启动子区域CC状态与转录正相关（ρ=0.49），而所有修饰状态（包括HM/MH）均呈负相关。组合分析发现启动子CC+内含子HC/CH可形成最强转录预测指标（ρ=0.54）。值得注意的是，HC/CH在基因上下游数kb范围内仍保持转录水平依赖性分布，暗示其可能作为广域转录激活标记。

讨论与展望

该研究揭示hmC的生物学功能高度依赖其双链上下文：HC/CH在转录活跃区域富集，而HM/MH在primed enhancer特异性出现。这种"双链表观密码"为理解细胞分化、疾病（如阿尔茨海默症、癌症）中hmC异常提供了新视角。未来研究可拓展至其他细胞类型，并探索不同CpG状态在DNA复制过程中的遗传机制。SCoTCH-seq技术的应用将推动表观遗传学进入双链解析的新纪元。