过表达MdWOX4增强苹果体细胞胚胎发生及遗传转化效率的分子机制研究

研究人员针对苹果遗传转化效率低、基因型依赖性强的瓶颈问题，通过建立以体细胞胚胎（SE）为受体的高效转化体系，结合CRISPR/Cas9基因编辑技术，揭示了生长素信号通路中MdARF5-MdWOX4调控模块促进胚胎细胞形成的分子机制。该研究将苹果转化效率提升至58.62%，为木本植物基因功能研究和种质改良提供了新策略。

　　

在果树育种领域，苹果作为全球重要的经济作物，其遗传改良长期受限于转化效率低、再生周期长等技术瓶颈。传统农杆菌介导的叶盘转化法存在强烈的基因型依赖性，而体细胞胚胎发生（Somatic Embryogenesis, SE）因其高遗传稳定性和双极特性，被认为是木本植物理想的遗传转化受体。然而，胚胎细胞形成的分子机制尚不明确，制约了SE技术在苹果中的应用。

针对这一挑战，西北农林科技大学风景园林艺术学院的研究团队在《Horticultural Plant Journal》发表最新成果，通过建立高效的SE介导转化体系，结合多组学分析和基因编辑技术，解析了生长素-MdARF5-MdWOX4级联反应调控胚胎细胞形成的分子通路。该研究不仅将苹果'嘎拉'品种的转化效率提升至58.62%，还首次揭示了WOX家族基因在苹果体细胞重编程中的核心作用。

研究采用四大关键技术：1）优化体细胞胚胎诱导体系（EIM/SEM培养基）；2）农杆菌介导的遗传转化参数筛选（OD₆₀₀=0.4，感染8分钟）；3）CRISPR/Cas9靶向编辑MdPDS基因验证体系；4）整合RNA-seq、酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率实验（EMSA）和双荧光素酶报告系统解析MdARF5-MdWOX4调控网络。

【体细胞胚胎发生介导的高效遗传转化体系】
通过优化2,4-D和NAA浓度组合，建立以叶片为外植体的SE诱导系统。关键参数测试显示，15 mg·L^-1卡那霉素和300 mg·L^-1头孢霉素可平衡抗菌效果与胚胎发生效率。经GUS染色验证，优化后的体系使转化效率达58.62%，较传统方法提升3倍。

【CRISPR/Cas9系统验证】
以MdPDS为标记基因构建pHSN401编辑载体，获得13.33%的编辑效率。突变体呈现典型白化表型，证实SE受体可有效避免嵌合体形成。

【MdARF5-MdWOX4调控网络的发现】
RNA-seq分析发现，生长素诱导8天后MdARF5表达量激增40倍。过表达MdARF5使体胚数量增加3-4倍，再生系数从5提升至13-17，而敲除株系完全丧失胚胎发生能力。

【MdWOX4的功能验证】
转录组数据揭示MdWOX4受MdARF5正向调控。过表达MdWOX4株系体胚数量达野生型6-7倍，成熟周期缩短10天。EMSA和双荧光素酶实验证实MdARF5通过结合MdWOX4启动子的AuxRE元件（TGTCTG）激活其转录。

该研究构建了"生长素-MdARF5-MdWOX4"调控模型：外源生长素激活MdARF5表达，其蛋白通过结合MdWOX4启动子促进胚胎细胞形成。这一发现不仅阐明了苹果体细胞重编程的分子开关，更通过过表达MdWOX4将体胚诱导周期从28天缩短至18天，为突破木本植物转化瓶颈提供了双重解决方案——既提高效率又缩短周期。研究建立的SE-CRISPR/Cas9联用体系，为苹果基因功能研究和精准育种奠定了技术基础。