HIV-1 Vpu通过泛素-蛋白酶体途径降解RBM10促进病毒感染的分子机制研究

本研究揭示了HIV-1辅助蛋白Vpu通过APEX2-MS和IP-MS技术鉴定到24个宿主互作靶点，其中RNA结合蛋白RBM10作为新型限制因子通过结合病毒RNA抑制不完全剪接转录本（4 kb）生成，同时激活干扰素刺激基因（ISGs）表达。Vpu通过跨膜区关键氨基酸（VAL-25/ARG-34/ASP-77）与RBM10结合，并依赖SCF E3泛素连接酶（BTRC/FBXW11）介导其降解，该发现为HIV-1逃逸宿主RNA监控机制提供了新视角。

　　

ABSTRACT

HIV-1辅助蛋白Vpu通过劫持宿主因子帮助病毒逃逸免疫监视。研究采用基于APEX2的邻近标记技术结合质谱分析，发现Vpu与RNA结合基序蛋白10（RBM10）相互作用，并通过泛素-蛋白酶体途径降解RBM10。RBM10能结合病毒RNA并减少不完全剪接的HIV-1转录本（4 kb），同时促进多种抗病毒基因转录。该研究阐明了Vpu在RNA复制阶段的新功能，并首次揭示RBM10作为HIV-1转录调控的关键宿主因子。

INTRODUCTION

HIV-1作为艾滋病病原体，其Vpu蛋白通过拮抗BST-2（tetherin）和CD4等宿主限制因子促进病毒释放。近年研究发现Vpu还影响病毒cDNA积累，但其在RNA生物合成中的作用尚不明确。本研究通过高灵敏度APEX2邻近标记技术，系统解析Vpu相互作用组，聚焦其与RNA加工通路的关联。

MATERIALS AND METHODS

实验采用TZM-bl细胞系（表达CD4/CCR5/CXCR4受体）和HEK293T细胞，通过Vpu-APEX2融合蛋白进行邻近标记。生物素化蛋白经链霉亲和素磁珠富集后，采用Orbitrap Fusion质谱仪进行定量分析。互作验证包括：

1. 纳米荧光素酶互补（NanoBiT）检测Vpu-RBM10直接结合
2. 免疫共沉淀（Co-IP）结合银染验证
3. 透射电镜观察Vpu的亚细胞定位（内质网/核周区域）
   关键突变体通过点突变（VAL25A/ARG34A/ASP77A）构建，病毒感染力采用TZM-bl荧光素酶报告系统评估。

RESULTS

Vpu宿主互作组特征
APEX2-MS鉴定到136个差异蛋白（Log₂FC>2），KEGG分析显示显著富集于RNA转运（P=3.2×10^-5）和剪接体通路（P=1.8×10^-4）。IP-MS筛选出97个互作蛋白，与APEX2数据交叉验证得到9个高置信靶点，包括已知靶点BTRC/FBXW11和新发现的RBM10。

Vpu-RBM10互作机制
冷冻电镜显示Vpu与RBM10在核周区共定位（Pearson系数0.40）。分子对接揭示Vpu跨膜区VAL-25/ARG-34/ASP-77与RBM10的LYS-106/GLN-87形成氢键（结合能-219.78 kcal/mol）。MG132处理可逆转Vpu诱导的RBM10降解（P<0.0001），而自噬抑制剂3-MA无此效应，证实依赖泛素-蛋白酶体途径。

RBM10的抗病毒功能
过表达RBM10使HIV-1感染力降低67%（P<0.0001），病毒颗粒产量减少52%。RIP-qPCR显示RBM10直接结合病毒RNA，导致：

1. 不完全剪接转录本（4 kb env）占比下降41%
2. 完全剪接转录本（1.8 kb rev）增加2.3倍
   蛋白质组学分析发现RBM10上调105个干扰素相关基因（如IFIT3/CXCL10），激活宿主抗病毒应答。

DISCUSSION

本研究首次揭示Vpu通过降解RBM10调控病毒RNA加工的新机制：

1. RBM10作为"分子剪刀"抑制HIV-1晚期转录本生成，其作用位点不同于已知剪接因子（如hnRNP A1）
2. Vpu利用SCF泛素化复合物（β-TrCP/BTRC）靶向降解RBM10，该策略与其降解BST-2的机制存在进化保守性
3. RBM10介导的干扰素通路激活为HIV-1免疫逃逸研究提供新方向

局限性在于未解析RBM10特异性识别病毒RNA的精确序列特征，后续可通过CLIP-seq等技术深入探索。该发现为开发靶向病毒RNA加工的小分子抑制剂（如干扰Vpu-RBM10互作的肽类化合物）提供了理论依据。