基于直接RNA测序技术解析仙台病毒复制回文基因组多样性及其感染调控机制

（编辑推荐）本研究通过优化直接RNA测序（DRS）技术，首次实现对仙台病毒（SeV）复制回文基因组（cbVGs）的全长无偏倚测序，突破传统PCR方法的技术局限。研究揭示cbVGs在病毒资源竞争、抗病毒应答激活中的关键作用，为单股负链病毒目（Mononegavirales）感染机制研究提供新工具。

　　

【DRS技术优化突破cbVG研究瓶颈】
传统PCR方法因依赖逆转录和扩增，难以准确捕获复制回文基因组（cbVGs）的全长序列。本研究创新性地设计32 nt特异性适配体寡核苷酸，将牛津纳米孔直接RNA测序（DRS）的cbVG捕获效率提升3倍。实验证实，仅需50 ng病毒RNA即可获得高保真序列，其中SeV Cantell株产生的546 nt主导性cbVG与宿主免疫激活密切相关。

【低样本量下的高精度验证】
在A549细胞感染模型中，DRS从低至17.6 ng培养基RNA中成功解析cbVG 546的完整结构。比对显示，50 ng与1000 ng输入样本的序列一致性达99.2%，但长同源聚体区域仍存在纳米孔特有的缺失误差。值得注意的是，动态调整适配体浓度至2 μM可减少80%背景噪音，而宿主rRNA仍是数据污染的主要来源。

【复杂cbVG群体的全景解析】
针对重组病毒株rSeVA和rSeVB，研究团队通过长读长cbVG分析脚本（LoCA）鉴定出26种新型cbVGs，包括长度达3240 nt的远端断裂变体。这些变体遵循副粘病毒"6n规则"，其断裂位点可延伸至参考基因组首位（如1_15,745型），该发现通过RT-PCR与DRS双重验证，证实其非PCR假象。

【技术局限与未来方向】
尽管DRS在cbVG定性分析中表现卓越，定量方面仍受宿主RNA干扰（占比达80%）。实验表明，核糖体去除（Ribozero）仅能提升总读长而无法改变病毒读长比例。研究预测，随着纳米孔技术改进，高二级结构的超长cbVGs（如含短环状区域者）将成为下一阶段攻关重点。

【方法论创新推动病毒学研究】
开发的LoCA分析流程摒弃传统假想断裂位点比对，直接通过BLAST验证双对齐读长，计算效率提升50%。该方法已成功应用于麻疹病毒脑组织样本分析，为单股负链病毒引起的亚急性硬化性全脑炎（SSPE）等疾病提供新的分子诊断思路。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献支持结论；技术参数如MOI 1.5 TCID₅₀/cell、Q-score 21等均保留原始表述）