BRCA1缺陷相关串联重复形成的分子机制：等位断裂诱导复制晚期步骤的调控作用

本研究针对BRCA1缺陷肿瘤中微同源介导的串联重复(TD)形成机制展开深入探索。研究人员通过构建无重复序列的TD报告系统和内源性位点特异性TD检测技术，揭示了等位断裂诱导复制(aBIR)晚期步骤的异常终止是导致TD形成的关键机制。研究发现BRCA1通过RAD51依赖和非依赖途径调控TD形成，其中BRCA1-BARD1复合物与RAD54在抑制TD形成中发挥重要作用。该成果为理解BRCA1缺陷相关基因组不稳定性提供了新视角，对癌症治疗策略开发具有重要指导意义。

　　

在癌症基因组中，串联重复(TD)是一种重要的结构变异，与肿瘤发生发展密切相关。BRCA1缺陷肿瘤表现出独特的TD特征：短跨度(通常<50kb)和微同源(MH)介导的连接点。这些特征性TD不仅是BRCA1缺陷的生物标志物，还能预测肿瘤对铂类化疗和PARP抑制剂的敏感性。然而，目前对BRCA1缺陷导致TD积累的分子机制仍不完全清楚，特别是在基因组缺乏相邻重复序列的区域。

浙江大学医学院附属邵逸夫医院普通外科浙江省腹腔镜技术重点实验室和浙江大学癌症研究中心的研究人员针对这一科学问题开展了深入研究。他们发现，在BRCA1缺陷的小鼠胚胎干细胞中，由复制偶联的单端DNA双链断裂(seDSB)诱导的TD显著增加，且不依赖于经典的非同源末端连接(c-NHEJ)。部分TD产物源于等位DNA合成后转向微同源介导的非等位姐妹染色体重组，表明BRCA1缺陷导致等位断裂诱导复制(aBIR)晚期步骤的提前终止。相关研究成果发表在《Nucleic Acids Research》上。

研究人员主要采用了四种关键技术方法：(1)构建无重复序列的TD报告系统；(2)开发基于PCR的内源性位点特异性TD检测技术；(3)利用CRISPR-Cas9系统诱导位点特异性DNA断裂；(4)采用液滴数字PCR(ddPCR)定量TD形成频率。这些方法组合实现了对TD形成机制的精确解析。

Premature termination of aBIR promotes TD formation in a repeat-less TD reporter
研究人员首先构建了无重复序列的TD报告系统，发现Cas9和Cas9n诱导的TD主要由aBIR-MMBIR(等位DNA合成后非等位再入侵)途径产生。在BRCA1缺陷细胞中，这种类型的TD显著增加，表明BRCA1在维持aBIR完整性中起关键作用。

BRCA1 suppresses TD generated by aBIR-MMBIR
通过比较BRCA1野生型和缺陷型细胞，研究发现BRCA1缺陷显著增加了由aBIR-MMBIR途径产生的TD，特别是Inv I/Ter I和Inv II/Ter II类型。值得注意的是，等位DNA合成可以修复Cas9/Cas9n诱导的断裂点，使这些点在TD产物中呈现"无疤痕"特征。

BRCA1 suppresses TD induced by replication-coupled seDSBs at natural genomic sites
在内源性基因组位点(H11、Rosa26和Col1a1)的分析表明，BRCA1缺陷同样增加了由复制偶联seDSB诱导的TD形成。这些TD既包括MMBIR直接产物，也包括aBIR-MMBIR产物，后者在BRCA1缺陷细胞中比例更高。

Enrichment of BRCA1-linked TDs is at least partly independent of RAD51
研究发现RAD51加载对TD形成具有促进作用而非抑制作用。BRCA1的CC结构域缺失(导致RAD51加载缺陷)并未增加TD，反而降低了TD水平。这表明BRCA1缺陷导致的TD富集至少部分独立于RAD51。

Post-resection steps of HR suppress BRCA1-linked TD formation
研究表明，HR的后期步骤如RAD54介导的同源搜索和链入侵，以及BRCA1-BARD1与RAD51的相互作用，在抑制TD形成中起关键作用。BARD1与RAD51相互作用的缺陷突变体(AAE)无法在BRCA1缺陷细胞中挽救TD抑制表型。

这项研究揭示了BRCA1缺陷导致TD积累的新机制：aBIR过程的异常终止和随后的非等位再入侵。研究不仅阐明了BRCA1在维持基因组稳定性中的多重作用，还为理解癌症中结构变异的形成机制提供了新视角。特别值得注意的是，研究发现等位DNA合成可以"掩盖"原始断裂点，这一发现对癌症基因组中结构变异的准确解析具有重要启示。此外，研究证实Cas9n诱导的TD频率在正常细胞中可超过1%，在BRCA1缺陷细胞中可达4%，这对基于Cas9n的基因组编辑技术的安全性评估提出了新的考量。

从临床角度看，这项研究为开发针对BRCA1缺陷肿瘤的新治疗策略提供了分子基础。通过靶向调控aBIR晚期步骤或干预非等位再入侵过程，可能成为增强BRCA1缺陷肿瘤治疗敏感性的新途径。同时，研究建立的TD检测方法为癌症基因组不稳定性的评估提供了新的技术工具。