增强型Eco1逆转录子编辑器实现无DNA双链断裂的人类细胞精准基因组编辑

本研究针对CRISPR-Cas9系统在人类细胞中模板修复效率低下的难题，通过改造Eco1逆转录子(retron)的非编码RNA(ncRNA)稳定性并优化sgRNA加工策略，开发出新型xrRNA-msr-msd-csy4-sgBFP编辑器。研究人员发现ncRNA降解和sgRNA 5'端延伸是限制效率的关键因素，采用寨卡病毒3'UTR的核酸酶抗性假结(xrRNA)和Csy4核糖核酸酶加工技术，使模板修复效率提升27倍，并首次实现nCas9介导的无双链断裂精准编辑。该成果发表于《Nucleic Acids Research》，为基因组工程提供了新工具。

　　

基因组编辑技术正在重塑生命科学研究的面貌，但现有工具仍面临诸多挑战。CRISPR-Cas9虽能精准定位基因组位点，但其依赖DNA双链断裂(DSB)的修复机制常导致非预期的插入缺失(indel)；碱基编辑器(base editor)虽可避免DSB，但每种突变类型都需要专门设计酶系统；而引物编辑器(prime editor)虽功能全面，但引导RNA(pegRNA)设计复杂，难以构建大规模文库。在这样的技术背景下，源自原核生物抗噬菌体防御系统的逆转录子(retron)因其能原位产生单链DNA(ssDNA)修复模板的特性，被视为极具潜力的编辑工具。然而，逆转录子在人类细胞中的编辑效率长期低下，其机制瓶颈尚未阐明。

纽约大学格罗斯曼医学院维尔切克生物医学研究生院(Vilcek Institute of Graduate Biomedical Sciences, NYU Grossman School of Medicine)的Matthew A. Cattle团队联合洛克菲勒大学(Rockefeller University)等机构，在《Nucleic Acids Research》发表重要研究成果。研究人员采用Northern blot、qPCR和流式细胞术等关键技术，通过构建BFP-GFP报告系统评估编辑效率，利用寨卡病毒3'UTR的核酸酶抗性假结(xrRNA)增强ncRNA稳定性，并引入Csy4核糖核酸酶精确加工sgRNA，最终开发出高效的新型逆转录子编辑器。

Eco1逆转录子编辑器效率低于合成ssDNA模板
通过BFP→GFP荧光转换模型比较发现，msr-msd质粒的编辑效率仅0.95%，而100nt合成ssDNA在6pmol剂量下可达10.73%。Northern blot显示融合sgBFP-msr-msd的ncRNA在稳定整合后几乎检测不到，提示降解可能是效率低下的关键因素。

稳态ncRNA水平受限于人类细胞环境
实验证实sgBFP与msr-msd融合转录本丰度显著低于单独sgBFP，且存在中间长度降解产物。通过慢病毒低拷贝整合模型进一步验证，完整长度sgBFP-msr-msd ncRNA无法被检出，而单独sgBFP表达良好。

ncRNA结构优化提升编辑效率
比较五种稳定化设计发现，引入xrRNA假结的xrRNA-msr-msd-sgBFP使编辑效率提升至1.83%。关键突变实验(C20G)证实假结的抗核酸酶特性是增效主因——xrRNA转录本半衰期超过8小时，而突变体仅20分钟。

Csy4切割实现无DSB编辑
组合xrRNA保护与Csy4加工策略后，在HEK293T和K562细胞系分别观察到2.26倍和10.63倍效率提升。特别重要的是，采用nCas9 H840A切口酶时，可实现无DSB的精准编辑，测序证实indel率仅约5%。

这项研究揭示了ncRNA稳定性在逆转录子编辑器效率中的核心作用，通过仿生学策略从寨卡病毒获得灵感，解决了长期制约逆转录子应用的关键瓶颈。所开发的xrRNA-msr-msd-evopreQ-csy4-sgBFP系统不仅编辑效率显著提升，更突破性地实现了无DSB的精准编辑，为需要避免NHEJ修复的应用场景提供了新选择。该技术兼容慢病毒递送系统，支持低拷贝整合和长期追踪，为大规模遗传筛选、癌症模型构建等研究开辟了新途径。研究者特别指出，未来结合PAM扩展型Cas变体或Cas12a的RNase活性，有望进一步拓展该系统的应用边界。