基于TaqTth-hpRNA系统的无序列限制性DNA大片段删除技术及其在阿尔茨海默病基因治疗中的应用

本研究开发了一种新型基因编辑工具TaqTth-hpRNA，通过重组TaqTth核酸酶（832 aa）与发夹RNA引导探针（hpRNA）的组合，实现了无需PAM（原间隔序列邻近基序）的DNA靶向切割。该系统在细菌基因组编辑中效率达80%，在哺乳动物细胞中通过微同源介导末端连接（MMEJ）通路诱导大片段缺失，并能精准区分单核苷酸突变（如阿尔茨海默病相关APPlon突变），为显性遗传病治疗提供了新策略。

　　

在基因编辑领域，CRISPR-Cas系统虽已广泛应用，但仍受限于原间隔序列邻近基序（PAM）要求和较大的蛋白尺寸。更棘手的是，传统编辑工具难以精准区分单核苷酸突变，这对显性遗传病治疗构成重大挑战。以阿尔茨海默病为例，APP基因的V717I（APP^lon）突变需要被选择性沉默而不影响野生型APP^wt。中国药科大学基础医学与临床药学学院的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表的研究，开发了一种突破性解决方案——TaqTth-hpRNA系统。

研究采用重组TaqTth核酸酶（融合TaqPol和TthPol结构域）与发夹RNA引导探针，通过体外生化实验验证ssDNA切割活性，建立大肠杆菌三质粒编辑系统，并在哺乳动物细胞中检测基因组编辑效果。关键实验包括：流式细胞术评估EGFP沉默效率、免疫荧光检测DNA损伤标志物53BP1、高通量测序分析编辑产物特征。

TaqTth-hpRNA的设计与体外验证
研究证实TaqTth可被hpRNA引导切割ssDNA，切割位点位于靶序列5'端1-2 nt处。通过随机核苷酸文库测试，发现该系统无PAM样序列限制。值得注意的是，hpDNA虽切割效率更高，但其3'瓣会被TaqTth延伸破坏，因此选择结构稳定的hpRNA作为引导工具。

细菌基因组高效编辑
在大肠杆菌中，双hpRNA引导的TaqTth对非必需基因arpB的编辑效率达80.3%。优化后的双质粒系统（p-TaqTth + p-biohpRNA）使编辑效率提升至81.4%，且细菌生长不受影响。通过插入随机核苷酸的质粒文库验证，该系统在6个位点均未显示序列偏好性。

哺乳动物细胞中的大片段删除
靶向EF1α启动子时，间隔0/8/20 bp的hpRNA对可使EGFP表达降低9%。靶向RB1启动子导致mRNA水平下降41.7%，并显著激活DNA损伤响应（DDR）通路，γH2AX表达增加3.5倍。测序发现编辑产物呈现1525-1909 bp的大片段缺失，断裂点含有5-25 bp微同源序列（MHS），提示MMEJ通路参与修复。定量PCR显示在HEK293T细胞中CCR5和EMX1位点的缺失效率分别为7.3%和9.2%。

单核苷酸区分能力
在靶向APP^lon突变（V717I）时，hpRNA-Lon-S1/A1组合选择性降低突变型APP mRNA 23.3%，而对野生型无影响。Western blot证实突变蛋白水平下降23.8%，测序发现APP位点存在含MHS的大片段缺失。

该研究开发的TaqTth-hpRNA系统具有832 aa的紧凑尺寸（适合AAV递送）、无PAM限制、高特异性及诱导大片段删除的特性。其创新性体现在：首次利用MMEJ通路实现可控的大片段删除，为外显子删除疗法（如Usher综合征）提供新工具；单碱基区分能力克服了CRISPR/Cas9对APP^lon等难靶位点的局限。尽管编辑效率仍需优化，但该系统为显性遗传病治疗提供了互补性技术路径，未来通过蛋白工程或有望进一步提升其临床应用潜力。