苹果MdMAPK6介导的MdWRKY9磷酸化通过MdERF5L互作调控果实成熟机制研究

本研究针对苹果果实成熟调控网络不明确的问题，揭示了WRKY转录因子MdWRKY9通过双重调控机制促进果实成熟的新通路。研究人员发现MdWRKY9不仅能与抑制因子MdERF5L互作解除其对MdACS1的转录抑制，还能被MdMAPK6磷酸化（Tyr394位点）增强稳定性。该研究通过瞬时转化、稳定转基因和蛋白互作验证等技术，首次阐明了MAPK-WRKY-ERF三级调控网络在苹果成熟中的作用，为精准调控果实成熟提供了新靶点。

　　

在水果产业中，苹果作为全球最重要的温带水果之一，其成熟过程的精准调控直接关系到果实品质和货架期。然而，果实成熟是一个复杂的生理过程，涉及多层次的调控网络，其中乙烯信号通路和转录因子调控机制仍是研究的重点难点。虽然已知乙烯响应因子（ERF）和WRKY转录因子家族在果实成熟中发挥作用，但二者如何协同调控、特别是翻译后修饰如何影响其功能，仍是未解之谜。

西北农林科技大学园艺学院的研究人员通过系统研究，在《Horticulture Research》发表了突破性成果。他们发现MdWRKY9通过双重分子机制促进苹果成熟：一方面直接结合MdERF5L启动子抑制其表达，解除MdERF5L对乙烯合成关键基因MdACS1的抑制作用；另一方面被MdMAPK6磷酸化（Tyr394）增强蛋白稳定性。这种"转录调控-蛋白修饰"的双重作用机制，为理解果实成熟调控提供了新视角。

研究采用的主要技术包括：苹果瞬时转化系统验证基因功能、酵母双杂交筛选互作蛋白、LCI和BiFC验证体内互作、LC-MS/MS鉴定磷酸化位点、体外激酶实验验证磷酸化修饰等。使用"瑞雪"和"泰山早霞"苹果品种及转基因番茄作为实验材料。

【MdWRKY9刺激苹果和番茄成熟】
通过发育期表达谱分析发现MdWRKY9表达与乙烯释放同步上升。瞬时过表达MdWRKY9使苹果提前黄化软化，乙烯合成基因MdACS1/MdACO1表达上调2-3倍；稳定转化番茄使成熟期提前3-8天，证实其促成熟功能具有跨物种保守性。

【MdWRKY9与MdERF5L互作调控成熟】
Y2H筛选发现MdWRKY9与抑制因子MdERF5L互作。EMSA和LUC证明MdWRKY9能竞争性抑制MdERF5L与MdACS1启动子的结合，解除其对乙烯合成的抑制。共转化实验显示MdWRKY9可逆转MdERF5L的成熟延迟效应。

【MdWRKY9转录抑制MdERF5L】
ChIP-PCR证实MdWRKY9直接结合MdERF5L启动子W-box元件，LUC报告系统显示其使MdERF5L启动子活性降低60%。遗传证据表明这是除蛋白互作外的第二重调控机制。

【MdMAPK6介导的磷酸化修饰】
LC-MS/MS鉴定出Tyr394磷酸化位点。体外激酶实验显示MdMAPK6特异性磷酸化该位点，细胞降解实验证明磷酸化使MdWRKY9半衰期延长2.3倍。在苹果中过表达MdMAPK6可增强MdWRKY9对成熟的促进作用。

这项研究首次绘制了"MdMAPK6→MdWRKY9→MdERF5L→MdACS1"的级联调控网络，揭示了磷酸化修饰在果实成熟中的关键作用。不仅完善了乙烯调控理论，更创新性地提出WRKY转录因子可通过"蛋白互作-转录抑制"双重机制精细调控成熟进程。该发现为开发基于分子设计的果实成熟调控技术提供了重要靶点，对实现果实品质精准调控具有重要应用价值。