综述：基于CRISPR的脊椎动物模型功能基因组学工具

这篇综述全面阐述了CRISPR-Cas技术在脊椎动物模型（如小鼠、斑马鱼）中的革命性应用，涵盖基因敲除（KO）、精确编辑（如碱基编辑器BE和先导编辑器PE）、转录调控（CRISPRi/a）及高通量筛选（MIC-Drop/Perturb-seq）等创新工具。作者强调其在功能基因组学研究和疾病建模（如镰状细胞贫血、肌萎缩侧索硬化ALS）中的转化潜力，特别指出单碱基编辑技术（CBE/ABE）和表观遗传编辑对临床治疗的突破性贡献。

　　

CRISPR技术革新脊椎动物功能基因组学研究

靶向诱变方法
CRISPR-Cas9系统通过引导RNA（gRNA）定向产生双链断裂（DSB），利用非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）实现基因敲除或敲入。斑马鱼研究中，Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物注射可实现高达99%的突变效率，而小鼠模型通过胚胎注射成功构建1200余种基因敲除品系。

双等位基因快速功能分析
优化后的CRISPR-F₀诱变技术（如Crispants）通过多gRNA组合或化学修饰的dgRNP复合物，在斑马鱼胚胎中实现>90%的双等位基因敲除，显著缩短表型分析周期。

精确基因组编辑的突破
碱基编辑器（BE）如CBE（APOBEC1融合）和ABE（TadA进化体）实现单碱基转换（C→T或A→G），而先导编辑器（PE）通过逆转录酶（MMLV RT）和pegRNA实现无需供体的精准插入/缺失。例如，ABE8e在脊髓性肌萎缩症（SMA）小鼠模型中成功修复SMN2基因的T·A→C·G突变，恢复运动功能。

转录与表观遗传调控
dCas9-KRAB（CRISPRi）和dCas9-VP64（CRISPRa）分别抑制或激活基因表达。表观遗传工具如dCas9-DNMT3A诱导DNA甲基化，而dCas9-TET1促进去甲基化，为研究基因剂量效应提供新思路。

高通量筛选技术
MIC-Drop将gRNA封装于微滴中单胚胎注射，实现体内大规模基因筛选；Perturb-seq结合单细胞转录组分析，在小鼠新皮质中解析自闭症风险基因的调控网络。

基因治疗的临床转化
镰状细胞贫血治疗通过靶向BCL11A增强胎儿血红蛋白表达获FDA批准，而AAV递送的ABE编辑器在早衰症小鼠中延长寿命2.5倍。Prime编辑技术则成功修复酪氨酸血症小鼠的Fah基因1.38 kb缺失。

未来挑战与展望
尽管CRISPR工具在效率（如PAM-less SpRY变体）和特异性（如缩小编辑窗口的ABE9）上持续优化，但体内递送效率仍是基因治疗的主要瓶颈。新型聚合酶介导的点击编辑（clkDNA模板）和双功能编辑器（A&C-BEmax）将进一步拓展应用边界。