综述：基因编辑与CRISPR依赖的同源介导末端连接

这篇综述深入探讨了CRISPR-Cas9系统在基因编辑领域的革命性应用，涵盖基因敲除（knockout）和基因敲入（knock-in）两大核心方向。文章系统解析了非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）的分子机制，并重点介绍了新兴的同源介导末端连接（HMEJ）技术如何突破传统HDR效率瓶颈。作者团队通过实验数据验证了ALT-R HDR Enhancer V2对单链寡核苷酸（ssODN） donor的增效作用，为基因治疗提供了新策略。

　　

引言

科学史上少数技术能像CRISPR-Cas9这样引发研究范式变革。这种RNA可编程核酸酶自2013年应用于哺乳动物基因编辑后，使得精确靶向人类基因组任何位点变得前所未有的简单。与单克隆抗体技术和PCR技术类似，CRISPR-Cas9不仅革新了基础研究手段，更开辟了基因治疗新纪元。

相关背景

基因编辑简史
从1985年Smithies首次尝试靶向人类β-珠蛋白位点，到2013年CRISPR-Cas9的横空出世，基因编辑技术经历了漫长进化。早期技术如锌指核酸酶（ZFN）和转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）虽取得突破，但存在设计复杂、效率低下等局限。CRISPR-Cas9通过单链向导RNA（sgRNA）的精确定位，实现了"一个基因一周编辑"的科研梦想。

DNA修复通路

• NHEJ通路：哺乳细胞优势修复途径，通过Ku70/Ku86异源二聚体识别断裂端，依赖DNA-PKcs和LIG4完成连接。该过程易产生插入/缺失突变（indel），是基因敲除的主要机制。
  
  
• HDR通路：需要RAD51介导的链入侵和BRCA1/2辅助，利用同源模板实现精确修复。虽然效率较低，但是基因敲入和基因治疗的基础。
  
  

CRISPR的多重应用

基因敲除
通过诱导NHEJ产生移码突变，CRISPR可实现高达79%的双等位基因敲除效率（表1）。全基因组敲除文库的建立，使得系统性筛选必需基因成为可能。

基因敲入
尽管HDR效率通常仅1-3%，但通过抑制NHEJ（如使用ALT-R HDR Enhancer V2）或激活RAD51，可将敲入效率提升5.9倍。表1显示在HCT116细胞中，ZEB1位点的敲入效率从33%跃升至79%。

CRISPRa/i系统
催化失活的dCas9与转录调控域融合后，可实现对基因表达的精确调控。光控或小分子诱导系统的开发，使表观遗传修饰的时空特异性操控成为现实。

安全性与创新

高保真Cas9变体（如eSpCas9）通过优化sgRNA设计，将脱靶效应降至检测限以下。而切口酶nCas9通过产生单链断裂，在保持编辑效率的同时显著降低基因组毒性。

HMEJ新机制
最新研究发现，通过设计含40bp同源臂的线性供体DNA，可在RAD52依赖的SSA样过程中实现>30%的大片段（6.3kb）无缝整合。图4展示了这种新型HMEJ通路与经典SSA的相似性：

挑战与展望

尽管CRISPR疗法在视网膜疾病和血液病中取得突破，但递送效率、免疫原性和伦理问题仍是主要障碍。特别是对于BRCA1等存在1800多种致病突变的基因，个体化治疗的成本控制亟待解决。未来，结合HMEJ和碱基编辑（base editing）的多重技术整合，或将开启精准医学新篇章。