综述：精准基因组编辑中的先导编辑技术新兴趋势

这篇综述系统阐述了先导编辑(Prime Editing, PE)技术的最新进展，从PE1到PE7的迭代优化（如pegRNA稳定化、MMLV-RT工程化、La蛋白融合），揭示了其通过nCas9(H840A)和逆转录酶(RT)协同作用实现无DSB的精准编辑机制。文章重点分析了PE在疾病建模（如CFTR-F508del校正）、农业育种（水稻OsACC1突变）和治疗应用（α-1抗胰蛋白酶缺乏症）中的突破，同时指出递送效率（AAV载体限制）和脱靶效应等挑战。

　　

先导编辑技术的架构与机制

先导编辑系统由nCas9(H840A)切口酶与工程化逆转录酶（MMLV RT）融合构成，通过特殊设计的pegRNA实现"搜索-替换"式编辑。pegRNA包含靶向序列和逆转录模板（RTT），当nCas9在非靶链产生切口后，3'-OH端启动逆转录，将编辑信息写入基因组。与依赖双链断裂（DSB）的传统CRISPR-Cas9不同，PE通过形成分支中间体（5' flap切除与3' flap连接）完成编辑，可实现12种碱基转换及小片段插入/缺失。

先导编辑系统的版本演进

从PE1到PE3的升级聚焦于编辑效率提升：

• PE1：原型系统在HEK293T细胞中效率仅10-20%
• PE2：优化RT热稳定性与亲和力，效率提升至20-40%
• PE3：增加辅助sgRNA在非编辑链制造切口，通过促进细胞以编辑链为修复模板，效率达30-50%

关键突破体现在PE4/PE5中引入显性负性MLH1（MLH1dn）抑制错配修复通路，使编辑效率提升7.7倍。PE6则通过噬菌体辅助连续进化获得紧凑型RT变体（PE6a-PE6g），适合AAV递送。最新PE7融合La(1-194)蛋白稳定pegRNA，在难编辑细胞类型中效率突破80-95%。

技术创新与优化策略

pegRNA工程化：3'端添加进化预Q（evopreQ1）或G-四链体结构，使epegRNA半衰期延长3-4倍。蛋白改造：nCas9(H840A+N863A)双突变将非预期indel降低60%。拆分系统：sPE将nCas9与RT分离表达，通过环状RNA模板实现双AAV递送，在小鼠肝脏中成功校正酪氨酸血症突变。

PAM限制突破：整合SpG/SpRY等变体使靶向范围扩展至非经典PAM位点，如BRAF V600E突变位点（原始SpCas9不可靶向）。Cas12a-PE系统利用T-rich PAM特性，在GC富集区域实现40.75%编辑效率。

应用场景拓展

大片段编辑：twinPE系统结合重组酶实现250bp片段精准插入；PE-CORE可删除亨廷顿病相关CAG重复序列。功能筛选：通过NNN随机密码子文库在OsACC1基因中筛选出除草剂抗性突变。疾病治疗：在苯丙酮尿症（PAH）小鼠模型中实现11.1%的基因组校正，酪氨酸血症模型达11.5%。

现存挑战与未来方向

递送瓶颈：PE蛋白（>4.7kb）超出单AAV容量，当前双AAV系统存在组装效率损失。新兴解决方案包括：

• 基于TnpB/IscB的微型编辑器（仅Cas9一半大小）
• 病毒样颗粒（VLP）递送RNP复合物
• 脂质纳米颗粒包裹circRNA模板

脱靶控制：PE-tag技术发现非经典pegRNA可能引发远距离脱靶，需开发高保真RT变体。随着DNA聚合酶编辑器（DPE）和点击编辑（CE）等新技术涌现，基因组编辑正迈向更高精度与灵活性的新时代。