综述：揭示不可见的基因组动态

这篇综述系统阐述了CRISPR-dCas9成像技术的发展与突破，通过工程化Cas蛋白和gRNA（guide RNA），结合肽标签与适体标记，实现了基因组位点的高灵敏度（S/N）、高特异性可视化。技术革新包括信号放大（SunTag）、背景抑制（split GFP）、多重标记（multiplexing）及单核苷酸分辨率（SNP-CLING），为研究染色质结构（chromatin）、基因组互作及疾病机制提供了革命性工具。

　　

引言

染色质作为真核细胞核内DNA与蛋白质的复杂网络，其动态变化直接影响基因表达调控。传统成像技术如DNA-FISH（fluorescence in situ hybridization）存在样本破坏性强、分辨率低等局限。CRISPR-Cas9系统的出现开辟了基因组可视化新纪元——通过失活型Cas9（dCas9）与荧光标记结合，实现了活细胞内特定基因位点的实时观测。

CRISPR成像系统的发展

CRISPR源自细菌免疫机制，其核心是gRNA引导的Cas9蛋白靶向切割DNA。2013年，研究者将dCas9（D10A/H840A突变）与EGFP融合，首次实现端粒等重复序列的活细胞成像

。该系统突破传统技术限制，仅需修改gRNA序列即可定位任意基因组区域，但非重复序列需30条gRNA才能检测。

信号放大策略

为提高灵敏度，研究者开发了三大策略：

1. 多荧光蛋白串联：dCas9直接连接3个EGFP，但更多拷贝会导致蛋白聚集。
2. RNA适体标记：如CRISPRainbow系统采用MS2/PP7/boxB适体，通过结合荧光蛋白的衣壳蛋白放大信号
   
   。
3. 肽标签系统：SunTag（24×GCN4肽段）可招募多个scFv-GFP，使信号增强10倍，甚至可检测单拷贝基因。

背景抑制技术

自由扩散的dCas9-gRNA复合物产生高背景噪声。创新解决方案包括：

• 分子信标（MB）：sgRNA嵌入淬灭荧光基团，仅靶向结合时发光
  
  。
• 光控核输出（CRISPR-LIBR）：蓝光诱导未结合荧光蛋白出核，S/N提升6倍。
• 降解标签（tDeg）：未结合Pepper适体的FP被快速降解，背景降低20倍。

多重成像与单碱基分辨率

通过不同物种Cas9（Sp/Nm/St1）的PAM差异或光谱分离适体，可实现多基因位点同步观测

。SNP-CLING技术将突变置于PAM区，仅需2条gRNA即可区分等位基因，为遗传病研究提供单碱基精度工具。

固定细胞成像突破

传统DNA-FISH需高温变性破坏染色质结构，而CASFISH直接应用预组装的dCas9-gRNA复合物，保留基因组三维构象。GOLDFISH技术结合切口酶（Cas9_dHNH）与超螺旋酶（Rep-X），实现局部解链与高密度探针标记，分辨率达单核苷酸水平。

挑战与前景

当前技术仍受限于大分子标记对染色质运动的干扰、gRNA设计限制及固定剂对蛋白互作的影响。未来结合超分辨显微技术，CRISPR成像有望揭示染色质纳米级结构与动态互作网络，为疾病机制和基因治疗研究开辟新途径。