综述：CRISPR工程活体基因组成像的进展与挑战

这篇综述深入探讨了CRISPR-Cas（dCas9/dCas12a）技术在活细胞基因组成像中的突破性应用，重点总结了通过优化sgRNA设计、荧光标记系统（如SunTag、Pepper-tDeg）及信号放大策略（如CasSABER、FISHer）实现非重复基因组位点单分子级成像的进展，同时警示了CRISPR-Cas可能引发的复制阻滞、R-loop形成等基因组不稳定性问题，为动态染色质研究提供了技术革新与风险平衡的视角。

　　

活体基因组成像的CRISPR工程：进展与挑战

引言

CRISPR-Cas技术从基因编辑工具发展为染色质动态研究的革命性手段，其核心在于利用核酸酶失活的dCas9/dCas12a蛋白与荧光标记系统结合，实现对特定基因组位点的实时追踪。早期技术依赖重复序列（如端粒、着丝粒）的冗余靶点，而近年突破则聚焦于非重复区域的单分子成像，为解析染色质三维组织与基因调控机制提供了新范式。

技术进展

信号放大与背景抑制

• 多价RNA支架：如CRISPR-Sirius通过在sgRNA四环区插入MS2/PP7等RNA适配体，显著提升信噪比（SNR）。
• 分裂荧光系统：Tripartite sfGFP将荧光蛋白拆分为三片段（GFP1-9/scFv-GFP10/MCP-GFP11），通过SunTag系统实现19倍信号增强，同时降低背景噪声。
• 相分离策略：CRISPR FISHer利用Foldon三聚化结构域介导的相分离，使非重复位点（如PPP1R2基因）的SNR提升246倍。

非重复位点成像突破

• 单sgRNA方案：Casilio系统通过PUF蛋白与sgRNA支架的15x结合位点招募多荧光蛋白，成功标记MUC4等单拷贝基因；Pepper-tDeg则依赖RNA适配体保护的降解域（tDeg），实现背景荧光的高效清除。
• CRISPR阵列：dCas12a可自主加工pre-crRNA为成熟crRNA，如CRISPRdelight通过12-48个crRNA的阵列实现CCAT1等位点的多重成像。

技术副作用

基因组代谢干扰

• 复制阻滞：dCas9结合可阻碍复制叉前进，诱发复制压力与姐妹染色单体分离延迟，甚至导致酵母CUP1位点的拷贝数变异。
• R-loop风险：CRISPR诱导的RNA-DNA杂交体可能抑制碱基切除修复（BER），增加胞嘧啶脱氨突变频率。
• 细胞毒性：高浓度dCas9表达会扰乱大肠杆菌分裂周期，并在人类细胞中引发TP53依赖性细胞周期停滞。

未来方向

优化递送系统（如脂质纳米颗粒封装RNP）与条件性表达控制是减少毒性的关键。结合新型荧光探针（如有机染料）与超分辨技术，CRISPR成像有望揭示发育、癌症中染色质重组的精确动态，但需严格评估其对DNA代谢的长期影响。

（注：全文严格基于原文数据，未扩展非提及内容）