基于CRISPR/Cas9技术靶向编辑CAR1基因提升酿酒酵母风味物质合成效率的研究

本研究针对传统发酵食品风味调控难题，创新性应用CRISPR/Cas9技术对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CAR1基因进行精准编辑（ΔCAR1缺失突变与Gln26stop无义突变），发现该操作可显著提升热带水果香型化合物异戊醇（+29.8%）和玫瑰香型苯乙醇（+79.5%）产量，同时降低致癌物氨基甲酸乙酯（EC）生成，为食品工业风味工程与安全控制提供了新策略。

　　

在食品工业领域，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的风味代谢调控始终是研究热点。传统发酵工艺中，风味物质的产生高度依赖菌株特性和环境条件，难以实现精准控制。更棘手的是，酵母在发酵过程中会通过精氨酸酶（CAR1基因编码）代谢产生潜在致癌物氨基甲酸乙酯（EC），这促使各国制定严格的EC限量标准（如JECFA建议每日摄入量≤15 ng/kg）。虽然已有研究通过CAR1基因失活降低EC风险，但该操作对风味物质合成的影响仍是未解之谜。

韩国首尔大学国际农业技术研究生院（Graduate School of International Agricultural Technology, Seoul National University）的研究团队在《LWT》发表的研究中，创新性地采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在三种不同遗传背景的酿酒酵母（SNUws、KCCM 51299和SNUit）中构建了两种CAR1突变体：完全缺失突变（ΔCAR1）和提前终止密码子突变（Gln26stop）。通过HS-SPME-Arrow-GC/MS（顶空固相微萃取-箭头气相色谱/质谱联用）分析发现，这两种突变均能显著提升关键风味物质产量，且不影响菌株生长和乙醇发酵能力，为食品风味精准调控开辟了新途径。

研究团队运用了多项关键技术：1）体外转录sgRNA直接递送技术避免质粒残留；2）CAO培养基（含150 mg/L刀豆氨酸）筛选精氨酸酶缺陷型突变体；3）MseI限制性酶切鉴定Gln26stop突变；4）HPLC监测发酵性能；5）靶向代谢组学分析挥发性化合物。

研究结果显示：

1. S. cerevisiae KCCM 51299 ΔCAR1和Gln26stop突变体风味分析
   GC-MS证实两种突变体均显著增加异戊醇（热带水果香）和苯乙醇（玫瑰香）产量，但中链脂肪酸及其酯类（如己酸乙酯）合成减少，提示CAR1失活可能通过氮代谢重编程影响脂质代谢。

2. CRISPR/Cas9编辑菌株的筛选验证
   通过PCR产物大小差异（ΔCAR1产生1kb片段vs野生型2kb）和MseI酶切（Gln26stop产生75bp/40bp片段）实现精准筛选，测序验证编辑准确性达100%。

3. 发酵性能评估
   三种菌株背景下的突变体均保持与野生型相当的生长曲线（DCW）和乙醇产量（HPLC检测），证明CAR1失活不影响基础发酵功能。

4. 风味物质定量分析
   SNUws菌株中，ΔCAR1和Gln26stop分别使异戊醇达315.52 mg/L（+29.8%）和312.95 mg/L（+28.7%），苯乙醇达72.82 mg/L（+79.5%）和58.71 mg/L（+44.7%）。类似趋势在SNUit菌株中也得到验证，表明该效应具有菌株普适性。

这项研究首次揭示了CAR1基因与酵母风味物质合成的内在联系：精氨酸酶失活可能通过阻断精氨酸-鸟氨酸转化，促使代谢流转向亮氨酸（异戊醇前体）和苯丙氨酸（苯乙醇前体）的Ehrlich降解通路。从应用角度看，该成果兼具双重价值——既可通过精准编辑提升理想风味化合物产量，又能同步降低EC安全风险，符合当前食品工业"减害增益"的发展趋势。尤其值得注意的是，研究中采用的Gln26stop点突变策略（仅4bp改变）相比传统转基因方法更易通过法规审查，为CRISPR技术在食品微生物改造中的合规应用提供了范本。未来研究可进一步解析CAR1失活对脂肪酸代谢网络的影响机制，并探索与其他风味通路（如ATF1酯合成酶）的协同编辑策略，以定制更复杂的风味谱系。