非细胞毒性小分子NPB通过抑制BAD Ser99磷酸化发挥抗肿瘤作用的机制验证与争议回应

针对Githaka等人质疑NPB通过形成胶体聚集体而非抑制BAD Ser99磷酸化发挥作用的争议，张曦团队通过多组实验验证NPB在细胞活力、3D培养及动物模型中均显示剂量依赖性抑制pBADS99的活性，并证实其作用依赖于BAD蛋白存在。研究为开发靶向BAD磷酸化的抗癌药物提供理论支撑。

　　

在肿瘤治疗领域，靶向凋亡调控蛋白BAD（Bcl-2-associated death promoter）的磷酸化位点一直是研究热点。BAD蛋白的Ser⁹⁹位点磷酸化（pBAD^{S99S99发挥作用，这一争议直接挑战了该靶点的成药性。}

为回应这一关键问题，深圳实验室的研究人员开展系统性验证研究。通过重新检测不同来源的NPB化合物（包括由University of Mysore提供的批次和第三方合成的对映异构体），研究团队证实：1）NPB在MCF-7和A2780细胞中仍呈现剂量依赖性的pBAD^S99抑制和细胞活力降低；2）非离子 detergent Tween-80的添加反而增强NPB活性，与胶体聚集导致假阴性的理论相悖；3）在3D Matrigel培养和动物模型中，NPB穿透屏障维持药效。这些结果有力反驳了胶体聚集是NPB主要作用机制的观点，同时揭示了细胞培养条件、抗体选择（如使用不同商业来源的pBAD^S99抗体）等因素可能导致实验差异。

关键技术方法包括：1）采用Alamar Blue和MTT法检测细胞活力；2）Western blot分析pBAD^S99和总BAD蛋白表达；3）3D Matrigel培养模拟体内微环境；4）对NPB对映异构体进行手性合成与活性验证。

研究结果：
NPB抑制BAD Serine(S) 99磷酸化并降低细胞存活
通过UM提供的NPB验证实验显示，10μM NPB处理48小时可使MCF-7细胞的pBAD^S99水平降低约50%（Western blot），细胞活力IC₅₀为8.2±0.6μM。时间梯度实验进一步证实pBAD^S99的动态调控受细胞密度影响。

非离子 detergent Tween-80增强NPB疗效
添加0.01% Tween-80使10μM NPB的细胞杀伤效果提升35%（P<0.01），这一现象与胶体聚集理论预测的"假阴性"结果相反。

对映异构体活性分析
第三方合成的S/R-NPB对映体（纯度98%）以1:1比例混合后，仍保持与原始NPB相当的抑制活性，且不同比例调配未显著改变药效，排除了批次间手性差异导致活性变化的可能性。

结论与意义：
该研究通过多维度实验证实NPB的抗肿瘤活性与pBAD^S99抑制直接相关，而非胶体聚集的假象。尽管NPB存在疏水性强的局限性，但其作用机制依赖于BAD蛋白的生物学特征——包括使用BAD敲除细胞、磷酸化位点突变体（BAD^S99A）等对照实验均支持这一结论。研究同时指出，胶体聚集可能被过度解读：FDA已批准药物如Fulvestrant、Sorafenib等均有聚集倾向但仍保持靶向活性。

这项工作不仅捍卫了pBAD^S99作为抗癌靶点的科学价值，更为后续开发口服生物利用度更高的BAD磷酸化抑制剂奠定基础。论文中揭示的实验条件差异（如细胞密度、抗体选择）也为领域内研究提供了重要方法学参考。