基于瞬时超紧凑型CRISPR-AsCas12f1系统的马克斯克鲁维酵母基因敲除技术

为解决马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)中非同源重组主导导致的基因敲除难题，研究人员开发了基于超紧凑型AsCas12f1蛋白(仅422个氨基酸)的瞬时靶向系统。通过整合tRNA-gRNA结构并敲除DNA修复基因KmKU70/KmLIG4，将敲除效率提升至近100%，同源臂缩短至200 bp仍保持87.5%效率。该技术首次实现酵母中Cas12f的应用，为微生物细胞工厂构建提供新工具。

　　

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)凭借快速生长、耐高温和广谱底物利用等特性，成为微生物细胞工厂的理想底盘。但该酵母中猖獗的非同源重组(Non-homologous end joining, NHEJ)机制严重阻碍基因编辑效率。

研究人员另辟蹊径，选用仅422个氨基酸的超紧凑型CRISPR相关蛋白AsCas12f1——其体积不足Cas9或Cas12a的三分之一，更易搭载于递送载体。通过设计瞬时靶向策略，在酵母中构建了"即用即弃"的基因敲除系统：

1. 创新性将tRNA与gRNA融合表达，显著提升引导RNA稳定性；
2. 敲除DNA修复关键基因KmKU70或KmLIG4后，编辑效率飙升至近100%；
3. 联合KmKU70缺失与AsCas12f1系统，同源臂长度从常规的1000 bp锐减至200 bp时，仍保持87.5%的敲除效率；
4. 开发gRNA-tRNA阵列系统，单次转化即获得三重基因敲除菌株，整体效率达86.4%。

这项研究不仅突破了马克斯克鲁维酵母基因编辑的技术瓶颈，更开创性地验证了Cas12f家族蛋白在真核系统中的适用性。其"瞬时转化-自主降解"的设计理念，避免了传统CRISPR系统需后续清除的繁琐步骤，为工业化菌株改造提供了高效快捷的新范式。