m6A修饰的EHD1通过调控PD-L1内体运输促进肺腺癌免疫逃逸及免疫治疗响应的机制研究

这篇研究揭示了EHD1通过m6A甲基化修饰（YTHDF1介导）增强mRNA稳定性，进而与PD-L1（程序性死亡配体1）胞内域结合，促进其内体循环并抑制溶酶体降解，最终上调PD-L1表达。该机制削弱了细胞毒性T细胞（CTLs）的杀伤能力，导致肺腺癌（LUAD）免疫逃逸。研究通过生物信息学筛选、体外共培养实验和免疫健全小鼠模型证实，靶向EHD1-PD-L1轴可显著增强抗PD-1疗法效果，为改善LUAD免疫治疗敏感性提供了新策略。

　　

Abstract

Eps15同源结构域（EHD）蛋白家族成员EHD1在肿瘤进展中发挥关键作用。本研究通过肿瘤免疫功能障碍和排除（TIDE）算法筛选发现，EHD1高表达与肺腺癌（LUAD）患者不良免疫治疗响应显著相关。机制上，YTHDF1通过识别^m6A修饰位点增强EHD1 mRNA稳定性，而EHD1蛋白通过其EH结构域与PD-L1胞内域直接互作，促进PD-L1从早期内体（EEs）经循环内体（ERC）再循环至细胞膜，同时抑制其通过溶酶体途径降解（LAMP1标记）。功能实验显示，EHD1敲除显著增强T细胞对LUAD细胞的杀伤效率（LDH释放率提升2.1倍），而EHD1过表达则抑制T细胞分泌干扰素γ（IFN-γ）。

Background

LUAD占全球癌症相关死亡率首位，其免疫逃逸机制涉及PD-L1等免疫检查点分子异常表达。EHD家族蛋白（EHD1-EHD4）调控膜受体运输，但EHD1在肿瘤免疫微环境中的作用尚未明确。本研究首次通过多组学分析揭示EHD1是预测ICB治疗响应的潜在标志物。

Methods

采用TIDE算法分析TCGA-LUAD数据集，结合生存分析筛选关键EHD成员。通过分子对接（PDB ID: 2JQ6与7XYQ）预测EHD1-PD-L1相互作用，免疫共沉淀（IP）和免疫荧光（IF）验证互作。甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP-qPCR）检测EHD1 mRNA的m⁶A修饰，RNA免疫沉淀（RIP）证实YTHDF1结合。构建EH结构域缺失突变体（EHD1^MUT1）和m⁶A位点突变体（EHD1^MUT2），通过放线菌素D（Act D）追踪mRNA稳定性。

Results

1. 免疫调控功能：EHD1敲除使LUAD细胞对T细胞杀伤敏感性提升3.5倍（E/T=5:1），凋亡标志物Bax/Bcl-2比值升高2.8倍。
2. PD-L1运输机制：EHD1缺失导致PD-L1与RAB11共定位减少60%，而与溶酶体标记物LAMP1共定位增加2.3倍。UbK63泛素化水平升高提示溶酶体降解增强。
3. 体内验证：在C57BL/6小鼠模型中，EHD1沉默联合抗PD-1治疗使肿瘤体积缩小72%（P<0.001），CD8⁺ T细胞浸润增加4.1倍。
4. 表观调控：YTHDF1通过结合EHD1 3'UTR区m⁶A位点（RRACH motif）延长其mRNA半衰期（从3.2小时至6.5小时），而K395A/Y397A突变体（YTHDF1^MUT）丧失此功能。

Conclusion

该研究阐明m⁶A-YTHDF1-EHD1-PD-L1轴在LUAD免疫逃逸中的核心作用，提出靶向内体运输通路可增强ICB疗效。临床样本分析显示EHD1与PD-L1表达呈正相关（R=0.38, P<0.01），为联合治疗策略提供理论依据。