人类足月蜕膜免疫细胞亚群的高参数全光谱流式分析：两种采样技术的比较研究及其在妊娠免疫调控中的意义

这篇研究通过22色全光谱流式细胞术（full-spectrum flow cytometry）系统比较了真空吸引法（Suc. decidua）与胎盘解剖法（Plac. decidua）获取的人类足月蜕膜组织免疫细胞组成差异。研究发现两种方法获得的免疫细胞群体高度相似，均富含CD56HiCD16? NK细胞、Tr1样调节性T细胞（LAG3+CD49b+）和PD-1Hi CD4+ T细胞等妊娠特异性亚群，而胎盘解剖法样本中Helios+ CD4+ T细胞比例更高提示可能存在胎儿细胞混杂。该研究为妊娠免疫微环境研究提供了方法学标准化依据。

　　

ABSTRACT

蜕膜作为子宫与胎儿的交界界面，其免疫细胞组成对维持妊娠稳态至关重要。研究比较了剖宫产术中真空吸引胎盘床（Suc. decidua）与胎盘子宫面解剖（Plac. decidua）两种采样技术，通过22色全光谱流式细胞术揭示了两种方法获取的免疫细胞图谱高度相似，但存在细微差异：真空吸引法样本中活细胞（CD45⁺）回收率更高（p≤0.05），而解剖法样本中Helios在CD4⁺ T细胞表达显著升高（p≤0.001），提示可能存在胎儿T细胞混杂。两种蜕膜样本均检测到外周血缺乏的Tr1样调节性T细胞（FOXP3^?LAG3⁺CD49b⁺）和PD-1^Hi CD4⁺ T细胞亚群。

1 Introduction

蜕膜根据解剖位置分为基蜕膜（decidua basalis）、壁蜕膜（decidua parietalis）和包蜕膜（decidua capsularis）。基蜕膜作为胎盘绒毛锚定区域，是研究免疫-滋养层相互作用的关键位点。既往研究多采用胎盘解剖法获取基蜕膜，但存在绒毛污染风险；真空吸引法虽能快速获取全胎盘床组织，但可能混入壁蜕膜成分。本研究首次通过高维流式技术（含CD94、CD49a等组织驻留标志物）系统比较两种方法的免疫细胞组成差异。

2 Materials and Methods

5名计划剖宫产孕妇纳入研究（表1），同步采集外周血单核细胞（PBMC）和两种蜕膜样本。组织经II型胶原酶消化后，采用包含LAG3、CTLA-4、Helios等22种抗体的panel进行染色，在Cytek Aurora平台完成检测。数据分析采用UMAP降维和FlowSOM聚类算法，统计使用GraphPad Prism 9进行配对t检验。

3 Results

3.1 主要免疫群体特征

UMAP分析显示两种蜕膜样本的CD4⁺ T细胞（Cluster 1）、CD8⁺ T细胞（Cluster 2）和NK细胞（Cluster 5）分布相似（图2A-B）。定量分析显示真空吸引法样本中CD45⁺活细胞比例更高（p≤0.05），而胎盘解剖法样本CD8⁺ T细胞频率更低（p≤0.05）。

3.2 T淋巴细胞谱系

CD3⁺ T细胞中鉴定出6个亚群（图3A），其中Cluster 2（CD8⁺CD25⁺TIGIT⁺）和Cluster 5（CD4⁺PD-1^Hi）在蜕膜中富集（1.4% vs PBMC 0.1%）。值得注意的是，胎盘解剖法样本中CD4⁺ T细胞的Helios表达量较真空吸引法高3倍（p≤0.001），Ki-67表达也有升高趋势（图4A）。

3.3 NK细胞表型

两种蜕膜样本均富含CD56^HiCD16^? NK细胞（图5B），其CD49a⁺CD94⁺组织驻留表型比例显著高于外周血（p≤0.001），但两种采样方法间无统计学差异（图5C）。

4 Discussion

该研究首次证实两种采样方法获得的蜕膜免疫细胞组成高度一致，但存在细微差异：真空吸引法更适合获取高纯度母体免疫细胞，而胎盘解剖法可能混杂胎儿来源的Helios⁺ T细胞。两种方法均能有效捕获妊娠特有的Tr1样调节性T细胞和PD-1^Hi CD4⁺ T细胞群体，为研究子痫前期、胎儿生长受限等妊娠并发症的免疫机制提供了标准化采样方案。未来研究可结合单细胞测序进一步解析两种方法获得的细胞转录组差异。