牙鲆源嗜腐迈阿密虫（纤毛虫纲：盾纤目）III型血清型的分离鉴定及其抗原特性研究

本文首次报道了韩国地区牙鲆养殖场分离的嗜腐迈阿密虫（Miamiensis avidus）III型血清型（serotype III）BB19菌株，通过cox1基因系统发育分析和血清型特异性PCR鉴定，发现其具有独特的34 kDa纤毛蛋白抗原，与现有I/II型疫苗毒株无交叉保护性，攻毒实验显示该菌株可导致65%累积死亡率，为水产疫苗研发提供了重要病原学依据。

　　

【ABSTRACT】

嗜腐迈阿密虫（Miamiensis avidus，同物异名Philasterides dicentrarchi）是导致韩日两国牙鲆（Paralichthys olivaceus）盾纤虫病的主要病原体。本研究从牙鲆中分离的BB19菌株经细胞色素c氧化酶亚基1（cox1）序列系统发育分析鉴定为嗜腐迈阿密虫cox1基因型IV型，血清型特异性PCR确认为III型。凝集试验和间接ELISA显示BB19仅与抗III型血清（Mie0301和BB19）发生特异性反应，Western blot揭示其特有的34 kDa蛋白区别于其他血清型的30/38 kDa蛋白。攻毒实验显示该菌株在1×10⁵ cells/fish浓度下可造成65%死亡率，提示现有基于I/II型血清型的疫苗可能无法提供交叉保护。

【1 Introduction】

盾纤虫病是全球海水养殖业最严重的寄生虫病之一，由纤毛虫门、寡膜纲、盾纤目原生动物引起。在韩国，嗜腐迈阿密虫是牙鲆养殖的主要致死病原，2015-2017年平均检出率达56.7%。目前韩国批准的两款疫苗（POSEIDON-ScuTECH和CTCVacc DaJaVa）仅含I/II型毒株，而日本已报道存在III型血清型。前期研究发现不同血清型间缺乏交叉保护，且单个养殖场可共存多个血清型，凸显血清型监测对疫苗研发的重要性。

【2 Materials and Methods】

2.1 纤毛虫分离与培养

2022年10月从济州岛发病牙鲆脑组织分离病原体，通过CHSE-214细胞系进行单克隆培养获得BB19菌株。对比菌株包括SJF-03B（I型）、JJB（II型）和A3（I/III型）。

2.3 cox1基因克隆与分析

使用通用引物F199d-B2/R1143d扩增900 bp的cox1基因片段，经pGEM-T载体克隆后测序，采用MEGA11软件构建邻接法（NJ）系统发育树。

2.4 血清型特异性PCR

根据纤毛蛋白基因设计引物：I型（443 bp）、II型（604 bp）、III型（350 bp），退火温度65°C，35个循环。

2.5 抗原性分析

2.5.1 抗血清制备：用6×10⁶ cells/mL福尔马林灭活菌体免疫新西兰兔，首次免疫使用完全弗氏佐剂（CFA），加强免疫用不完全弗氏佐剂（IFA）。

2.5.2 凝集试验：2×10⁵ cells/mL菌体与系列稀释抗血清反应，显微镜观察凝集效价。

2.5.3 间接ELISA：100 ng/孔全细胞蛋白与1:4000稀释抗血清反应，TMB显色测定OD₄₅₀。

2.5.4 Western blot：12% SDS-PAGE分离10 μg蛋白，转膜后与1:4000抗血清孵育，检测特征条带。

2.6 毒力试验

牙鲆稚鱼（15.11±1.83 g）腹腔注射1×10³-10⁵ cells/fish剂量，记录25天累积死亡率。

【3 Results】

3.1 cox1基因分析

BB19与日本株Mie0301（EU831233）同属cox1 IV型，bootstrap支持率100%，区别于韩国主流I/II型毒株。

3.2 血清型鉴定

BB19产生350 bp特异性条带，与Mie0301纤毛蛋白基因（LC269182.1）100%同源；A3株同时扩增出443/350 bp条带，提示I/III混合血清型。

3.3 抗原特性

凝集试验显示抗BB19血清效价达80，且仅与同源抗原反应。Western blot揭示BB19特异性表达34 kDa蛋白，而I型（SJF-03B）和I/III型（A3）为30 kDa，II型（JJB）含30/38 kDa双条带。

3.6 毒力特征

BB19在1×10⁵ cells/fish剂量下致死率达65%，与II型JJB相当，显著高于I型SJF-03B（15%）。

【4 Discussion】

本研究首次证实韩国存在嗜腐迈阿密虫III型血清型，其cox1基因型与日本Mie0301高度保守。血清学特征显示34 kDa纤毛蛋白是III型的标志性抗原，与现有疫苗毒株（I/II型）无交叉反应。毒力实验表明BB19具有强致病性，提示水产疫苗需纳入多血清型抗原。值得注意的是，长期体外传代可能导致毒力衰减（如SJF-03B），而自然分离株（BB19）保持高毒力，这对疫苗种子株筛选具有指导意义。该发现为东亚地区盾纤虫病防控提供了新的病原学依据，后续研究应关注III型的地理分布及分子流行病学特征。