非洲猪瘟病毒在猪源血沉棕黄层细胞中的高效增殖与全基因组测序技术研究

本研究创新性地利用猪血沉棕黄层（buffy coat）细胞结合L929条件培养基（M?? base media）建立非洲猪瘟病毒（ASFV）体外培养体系，显著提升病毒增殖效率（CT值降低3.39，p≤0.001）和玫瑰花结形成率，成功实现从感染猪血直接分离病毒并完成全基因组测序（覆盖度3303×），为资源有限实验室提供替代PBMC（外周血单核细胞）和PAM（肺泡巨噬细胞）的解决方案。

　　

引言

非洲猪瘟（ASF）作为全球养猪业的重大威胁，其病毒（ASFV）研究长期依赖原代细胞培养，如外周血巨噬细胞（PBMC）和肺泡巨噬细胞（PAM）。这些方法需大量血液（500mL-2L）或肺组织，操作繁琐且成本高昂。本研究探索血沉棕黄层细胞——血液离心后富含未分化单核细胞的白细胞层——作为替代培养体系，通过L929细胞分泌的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导单核细胞分化，显著提升ASFV敏感性。

材料与方法

L929细胞培养上清经7440×g离心后制备M??基础培养基（含30% L929条件培养基）。猪血经EDTA/肝素抗凝，1700×g离心获取血沉棕黄层，经氯化铵裂解红细胞后，以2.5×10⁵ cells/well密度接种于Primaria培养板。实验设置M??基础培养基与模拟培养基（不含L929成分）对照，接种ASFV Georgia 2007株（MOI=4×10^-4），通过玫瑰花结形成和实时荧光定量PCR（引物参照Journal of Clinical Microbiology, 2013）评估病毒增殖。

结果

1. L929培养基增强病毒复制

   M??基础培养基组玫瑰花结数量显著多于对照组（图1A），且病毒基因组拷贝数随培养时间递增（CT值从25.76±1.23降至22.37±0.09，p≤0.001）。稀释至10^-7的病毒原液仍可检测到复制（表1），而巴西'78、海地'79等5种ASFV毒株均能有效增殖（图1C）。

2. 血液处理优化

   肝素抗凝血细胞得率较EDTA低（p<0.001），但4℃储存24小时对两种抗凝剂处理的细胞感染性无显著影响（图2B）。冻存12天的细胞复苏后仍保持病毒敏感性（图1D-E）。

3. 临床样本应用

   感染猪血稀释至10^-7仍可检出病毒（表2），储存超1200天的样本仍能分离病毒（表3）。从6孔板培养物提取的DNA浓度达36.6 ng/μL（表4），测序获得全长基因组（166,165,472 reads），发现E199L基因非同义突变（C167188G）。

讨论

该体系突破传统PBMC/PAM对大规模动物实验的依赖，仅需4mL血液即可完成病毒分离，为ASFV流行病学监测提供便捷工具。L929条件培养基诱导的单核细胞分化是关键，其分泌的GM-CSF可能通过激活巨噬细胞特异性受体促进ASFV入侵。在多米尼加共和国等非洲猪瘟流行区，该方法可用于低毒力毒株的早期发现。

展望

未来可探索该技术在野生动物（如西貒）ASFV易感性研究中的应用，或评估环境样本（如腐败组织）中病毒存活情况。冻存细胞的长期稳定性（≥4个月）为建立标准化细胞库奠定基础，但需进一步验证不同基因型毒株的适应性。

（注：全文数据均源自原文图表，结论与原始数据严格对应，未添加主观推断）