木糖代谢工程改造Komagataella phaffii酵母菌株实现1,2,4-丁三醇生物合成及工艺优化研究

（编辑推荐）本研究首次在Komagataella phaffii酵母中构建了木糖氧化途径，通过过表达木糖脱氢酶(XylB)、木糖酸脱水酶(XylD)和2-酮酸脱羧酶(KDC)，实现1,2,4-丁三醇(BTO)的生物合成。采用中心复合设计(CCD)优化培养条件后，BTO产量提升147%达1.3 g/L，为生物基化学品生产提供了新平台。

　　

代谢工程改造Komagataella phaffii实现木糖到1,2,4-丁三醇的生物转化

1 引言

木质纤维素作为可再生资源，其第二大组分木糖可通过微生物转化为高附加值化学品。1,2,4-丁三醇(BTO)作为四碳多元醇，是医药、聚合物和含能增塑剂1,2,4-丁三醇三硝酸酯(BTTN)的关键前体。传统化学合成法存在步骤繁琐、污染严重等问题，而微生物合成展现出巨大潜力。

研究团队在Komagataella phaffii（原Pichia pastoris）中构建了木糖氧化途径：木糖经木糖脱氢酶(XDH)催化生成木糖酸，再通过木糖酸脱水酶(XD)转化为2-酮-3-脱氧木糖酸(KDX)，最终经2-酮酸脱羧酶(KDC)和内源性醛还原酶作用生成BTO。该酵母具有高密度培养、酸性耐受等工业优势，但其天然木糖代谢能力较弱，需通过代谢工程改造。

2 材料与方法

实验采用两种木糖酸脱水酶基因（来自Caulobacter crescentus的xylD-CC和Halomonas lutea的xylD-HL）与乳酸乳球菌的kivD（KDC）进行组合表达。通过电转化将基因整合至X-33菌株，在含葡萄糖/木糖的YPDX或FM22培养基中培养。

关键创新点包括：

• 采用中心复合设计(CCD)系统优化溶解氧(2%-20%)和pH(5-8.5)条件

• 建立细胞干重与OD₆₀₀的换算关系（g_DCW/L=0.354×OD₆₀₀）

• 通过HPLC定量分析BTO、木糖酸等代谢物

3 结果与讨论

3.1 途径构建与验证

工程菌株X-33 HL HL KDC在10 g/L葡萄糖+10 g/L木糖的矿物培养基中产量达395.4 mg/L，较YP培养基提高2.7倍。研究发现：

• K. phaffii内源性醛还原酶可催化最后一步转化

• 葡萄糖比例影响产量，1:1糖比时产量最高(513 mg/L)

• 木糖酸积累表明XD是途径限速步骤

3.2 工艺优化

CCD模型显示pH 6.54-6.57和11%溶解氧为最佳条件：

• 模型预测误差<6%（nRMSE=10.17%）

• 碱性pH(>8)导致细胞活性丧失

• 高氧(20%)会抑制铁硫簇依赖的XD酶活性

3.3 细胞密度影响

初始OD₆₀₀=20时产量达1.269 g/L，较基础条件提升147%。动力学分析显示：

• 最大比生产速率出现在培养40小时

• 葡萄糖耗尽后细胞生长停滞

• 补料策略可能进一步提高产量

4 结论

本研究首次在K. phaffii中实现BTO生产，通过：

• 引入异源xylB-xylD-kivD基因组合

• 优化pH和氧传递的协同效应

• 确定高细胞密度培养优势

与已报道的E. coli(5.1 g/L)和S. cerevisiae(6.6 g/L)相比，当前产量(1.3 g/L)仍有提升空间。未来可通过多拷贝整合限速酶基因、改造辅因子平衡或调控木糖酸转运等策略进一步优化。这项工作为K. phaffii作为生物基化学品生产平台提供了新范例。