综述：DNA无限制性重叠序列克隆技术在合成生物学中的应用综述

这篇综述系统梳理了合成生物学中主流的DNA无限制性重叠序列克隆（RFOSC）技术，涵盖体外（Gibson Assembly、CPEC、PIPE等）和体内（YHR、TAR、PEDA等）方法，强调技术选择需结合项目规模与需求，并展望了酶促效率、宿主兼容性与自动化融合的未来趋势。

　　

ABSTRACT

DNA克隆技术作为分子生物学和合成生物学的核心工具，其发展直接推动了基因操作的精准化。近年来，无限制性重叠序列克隆（RFOSC）技术因其无需酶切位点的特性成为研究热点。本文系统评述了当前主流RFOSC技术的原理与应用场景。

体外组装技术

• Gibson Assembly：利用T5外切酶、DNA聚合酶和连接酶的协同作用，实现单次反应中多片段无缝拼接，效率可达90%以上。

• CPEC（环形聚合酶延伸克隆）：通过高保真聚合酶循环延伸重叠引物，尤其适用于质粒构建，但片段长度限制在10 kb内。

• UDG-Cloning：基于尿嘧啶糖基化酶的特异性切除，兼容常规载体，适合高通量操作。

杂交技术如LIC（连接非依赖克隆）和SLIC（序列非依赖克隆）通过控制酶切活性平衡，显著降低载体背景噪声。

体内重组系统

• YHR（酵母同源重组）：利用酵母天然重组机制，可组装>100 kb的超长片段，但转化效率受宿主状态影响。

• PEDA（噬菌体酶辅助直接组装）：创新性引入λ噬菌体末端酶，实现原核系统的高效线性DNA拼接。

技术选择指南

实验规模决定方法优先级：小片段（<5 kb）优选Gibson或CPEC；大片段需采用YHR或TAR（转化相关重组）。值得注意的是，商业试剂盒（如In-Fusion）虽简化流程，但成本较高。

未来展望

自动化微流控平台与人工智能辅助设计将进一步提升RFOSC的标准化程度，而古菌重组酶的发掘可能突破现有宿主限制。

Conflicts of Interest

作者声明无利益冲突。