综述：DNA甲基化技术进展及其在癌症诊断中的应用

这篇综述系统阐述了DNA甲基化（5mC/5hmC）检测技术（如亚硫酸盐测序、MSRE酶切法、酶转化法和三代测序）的最新进展，及其作为生物标志物在肿瘤早期诊断中的应用价值。文章重点探讨了液体活检（ctDNA）、组织样本的多组学分析策略，以及人工智能（AI）驱动的甲基化模型在提升癌症筛查特异性（AUC>0.9）方面的突破性贡献。

　　

DNA甲基化检测技术的前沿进展

ABSTRACT
DNA甲基化作为关键的表观遗传修饰，通过调控CpG岛（CGIs）的甲基化状态影响基因表达。在肿瘤发生过程中，启动子区CGIs的高甲基化会导致抑癌基因沉默，这一特征使其成为理想的癌症诊断标志物。近年来，单碱基分辨率测序技术和液体活检的融合，显著提升了甲基化检测在临床转化中的应用潜力。

DNA甲基化在癌症诊断中的应用
肿瘤组织活检虽是金标准，但液体活检（血浆、尿液等）因其无创性更适用于早期筛查。循环肿瘤DNA（ctDNA）中甲基化标志物如SEPT9（结直肠癌）和RASSF1A（乳腺癌）的检测灵敏度可达86.4%-93.2%。值得注意的是，外周血单个核细胞（PBMCs）的甲基化谱能反映系统免疫响应，为癌症诊断提供新视角。

检测方法
亚硫酸盐转化技术
作为金标准，亚硫酸盐将未甲基化胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化C（5mC）保持不变。甲基化特异性PCR（MSP）和焦磷酸测序可靶向分析特定位点，但全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）存在DNA降解风险。新兴的酶转化技术（如EM-seq）通过TET2和APOBEC3A酶组合，在保留DNA完整性的同时实现5mC/5hmC区分。

限制性内切酶法
甲基化敏感酶（如HpaII）与CRISPR-Cas12a联用的MeCRISPR技术，灵敏度达0.01%，能检测1拷贝/μL的甲基化DNA。而甲基化依赖性酶MspJI结合NGS的MDRE-seq，可低成本覆盖50%以上甲基化CpG位点。

三代测序
牛津纳米孔（ONT）通过电流信号差异直接识别5mC，结合深度学习算法DeepMod使单碱基准确率达99%。PacBio SMRT测序则利用聚合酶动力学延迟检测甲基化，但需高测序深度（>30X）保障准确性。

人工智能驱动的新范式
机器学习模型通过整合甲基化组、片段组学和拷贝数变异（CNV）数据，构建多癌种早筛模型。例如，SPOT-MAS系统对5种癌症的检测特异性达94.7%，显著优于传统血清标志物（CEA/CA19-9）。卷积神经网络（CNN）在肺恶性肿瘤鉴别中实现98.6%的敏感度，凸显多模态分析的临床价值。

挑战与展望
当前瓶颈包括：cfDNA低丰度（早期肿瘤<0.1%）、酶转化效率优化（APOBEC3A活性调控）、以及三代测序成本控制（ONT芯片$900/次）。FDA已批准Epi proLung?等甲基化IVD试剂盒，但标准化检测流程和自动化分析平台仍是未来研发重点。

Abbreviations
5mC：5-甲基胞嘧啶；5hmC：5-羟甲基胞嘧啶；CGIs：CpG岛；ctDNA：循环肿瘤DNA；PBMCs：外周血单个核细胞；MSP：甲基化特异性PCR；WGBS：全基因组亚硫酸盐测序；EM-seq：酶转化测序；ONT：牛津纳米孔技术；CNV：拷贝数变异