SnRK2.6对芍药远缘杂交花粉管生长的影响及对ABA的响应

　　

摘要：

【目的】 从芍药转录组筛选SnRK2基因，探究芍药SnRK2介导ABA通路调控芍药属远缘杂交花粉萌发和花粉管生长的分子机制，为克服芍药属远缘杂交不亲和提供理论依据。【方法】 基于芍药柱头转录组数据（NCBI登录号：PRJNA592882），筛选ABA信号通路基因和第Ⅲ亚组SnRK2基因PlSnRK2.6；克隆PlSnRK2.6，并进行生物信息学分析和亚细胞定位；采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定芍药自交、杂交后4、8、12、24和36 h的柱头内ABA激素含量，以及目的基因相对表达量。外施ABA及其抑制剂后，测定芍药自交与杂交不同时期柱头中PlSnRK2.6的相对表达量；通过Y2H试验筛选PlSnRK2.6的互作蛋白。【结果】 通过体外花粉培养发现，与正常培养基相比，ABA培养基中花粉的萌发率和花粉管长度显著降低，表明ABA对牡丹花粉的萌发与花粉管生长具有抑制作用。通过芍药转录组筛选ABA信号通路中调控离子运输的KAT1、调控ROS产生的RBOHF、蛋白激酶SnRK2、蛋白磷酸酶PP2C、ABFs和ABI家族基因。qPCR分析结果显示，在ABA信号通路中，与芍药自交相比，PlSnRK2.6和PlRBOHF的表达量显著升高；PlKAT1表达量下降；PlABF2、PlABI5表达量呈先上升后下降的趋势，该趋势与转录组中FPKM值趋势一致。经转录组筛选克隆的PlSnRK2.6 CDS全长为1 092 bp，编码363个氨基酸，经基因结构分析比对，发现其具有显著的STKc_SnRK2-3保守结构域；多物种系统进化关系表明，SnRK2家族可分为3个亚家族，PlSnRK2.6属于第Ⅲ亚组，其中，PlSnRK2.6与牡丹、拟南芥的SnRK2.6聚类到同一分支。PlSnRK2.6与蛇莓SnRK2.6亲缘关系最近，同源比对发现SnRK2-3结构域较为保守。亚细胞定位显示，PlSnRK2.6蛋白定位于细胞核。芍药杂交组合中的ABA含量在大部分时期高于自交，PlSnRK2.6表达量同样高于自交，在24和36 h较为显著，其杂交时期的表达量分别是自交的8.94和5.07倍。ABA响应试验发现PlSnRK2.6对ABA具有明显的响应性，其表达趋势在授粉后期更为明显。酵母双杂交试验显示，PlSnRK2.6不具有自激活特性，与PlACP1、PlHMGB3有相互作用。【结论】 筛选出响应ABA诱导的蛋白激酶PlSnRK2.6，其在芍药远缘杂交柱头中高表达，与PlACP1和PlHMGB3相互作用。推测PlSnRK2.6及其互作蛋白通过ABA信号通路调控花粉萌发和花粉管生长，可能在调节芍药远缘杂交不亲和性过程中发挥关键作用。