基于理性设计与分子动力学模拟的GH10木聚糖酶热稳定性优化及与纤维素酶的生物能源协同增效研究

本研究针对工业生物质降解中木聚糖酶(GH10 Xylanase)热稳定性不足的关键问题，通过FoldX5理性设计筛选G29L/H218A双突变体(M3)，结合分子动力学(MD)模拟揭示其耐热机制。突变体在50℃下半衰期延长85%达18.5h，催化效率提升4.8倍(240 vs 50 mL·s-1·mg-1)，与纤维素酶(CEL)协同水解经"海水+Fenton"预处理的甘蔗渣可使还原糖产量提升152%。该研究为开发高效生物质转化酶制剂提供了新策略。

　　

在全球能源危机与环境压力日益加剧的背景下，如何高效利用地球上最丰富的可再生碳资源——木质纤维素，成为生物能源领域的关键科学问题。甘蔗渣作为典型的农业废弃物，虽含有38-50%的纤维素和23-32%的半纤维素，但其复杂的交联结构使得酶解效率低下。更棘手的是，工业生物质降解过程需要在50℃左右进行，而现有木聚糖酶普遍存在热稳定性差（50℃下半衰期<5h）和催化效率低（<200 U/mg）的双重缺陷，严重制约生物质转化效率。

江苏科技大学蚕业研究所生物技术学院的研究人员选择来自褐腐真菌(Gloeophyllum trabeum)的GH10家族木聚糖酶GtXyn10（PDB:4XX6）作为研究对象，该酶虽具有340 U/mg的比活力和10h的50℃半衰期，但仍不能满足工业化需求。通过FoldX5软件计算ΔΔG值筛选突变位点，结合分子动力学模拟和酶学表征，最终获得性能显著提升的工程酶，相关成果发表在《Industrial Crops and Products》上。

研究主要采用四项关键技术：1)基于FoldX5算法的ΔΔG值预测筛选热稳定突变体；2)毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115表达系统进行酶蛋白生产；3)分子动力学模拟（AMBER 14软件包）分析构象稳定性；4)"海水+Fenton"组合预处理技术增强底物可及性。实验使用甘蔗渣作为原料，通过扫描电镜(SEM)和DNS法分别评估结构变化和还原糖产量。

3.1 FoldX5增强木聚糖酶热稳定性
通过ΔΔG计算从14个位点筛选20个突变体，其中G29L和H218A单突变体残余活性分别提高220%和567%。分子动力学模拟显示突变引入的新氢键和盐桥是稳定性提升的关键。

3.2 突变体酶学性质表征
双突变体M3在pH 2.0-10.0范围内保持稳定，最适温度提升至80℃。差示扫描量热(DSC)显示其熔解温度(T_m)提高7.2℃达71.3℃，50℃下半衰期延长至18.5h。

3.5 热稳定性机制解析
50ns MD模拟表明M3的RMSD值较野生型降低17.8%，新形成的盐桥(D184-K193等)和氢键网络使蛋白骨架更刚性。结合自由能计算显示M3与底物结合能降低至-13.8 kcal/mol。

3.6 动力学参数优化
以山毛榉木聚糖为底物时，M3的k_cat/K_m值达240 mL·s^-1·mg^-1，比活力提升至780 U/mg，显著高于野生型的50 mL·s^-1·mg^-1和340 U/mg。

3.9 甘蔗渣协同降解
"海水+Fenton"预处理后，M3与纤维素酶协同作用使还原糖产量达834.4 mg/g，较单独使用纤维素酶(330.8 mg/g)提高152%，协同度(DS)达1.6。扫描电镜显示处理后的甘蔗渣出现明显的纤维解离。

该研究通过理性设计与计算生物学相结合的策略，成功获得兼具优异热稳定性和催化效率的GH10木聚糖酶。其创新性体现在三方面：首先，ΔΔG导向的突变体筛选方法将实验规模缩减至20个突变体，极大提高了研发效率；其次，首次阐明G29L/H218A突变通过增强局部刚性和拓宽底物通道实现"稳定性-活性"双提升的分子机制；最重要的是，开发的"海水离子催化-Fenton氧化-双酶协同"三级处理体系，为木质纤维素生物炼制提供了经济高效的解决方案。这项研究不仅为工业酶分子设计提供了新范式，其产生的M3突变体更可直接应用于生物燃料、造纸等产业，具有重要的科学价值和应用前景。