膜蛋白CRISPR筛选揭示RPSA作为猪流行性腹泻病毒复制的关键宿主因子及其ERK1/2-脂代谢调控机制

本研究通过构建猪膜蛋白CRISPR/Cas9敲除文库（PigMpCKO），首次鉴定核糖体蛋白SA（RPSA）为猪流行性腹泻病毒（PEDV）复制的关键宿主因子，揭示其通过激活ERK1/2信号通路调控脂质代谢的新机制，为猪肠道冠状病毒（SeCoVs）广谱抗病毒靶点开发提供理论依据。

　　

膜蛋白CRISPR筛选揭示RPSA的病毒调控网络

CRISPR敲除文库筛选鉴定PEDV关键宿主因子
研究团队构建了靶向1,607个猪膜蛋白基因的CRISPR/Cas9敲除文库（PigMpCKO），通过两轮PEDV-GDU-GFP毒株感染筛选，发现核糖体蛋白SA（RPSA）是影响病毒复制的核心靶点。实验验证显示，RPSA敲除显著降低PEDV-YN144毒株的病毒滴度（TCID₅₀下降>90%），而回补实验证实其功能可被拯救。有趣的是，尽管RPSA是登革病毒等病原体的已知受体，但抗体阻断和免疫共沉淀（Co-IP）实验排除了其作为PEDV受体的可能性。

RPSA调控病毒复制而非入侵阶段
通过时序感染实验发现，RPSA敲除细胞中正链（+vRNA）和负链（-vRNA）病毒RNA合成分别在感染后4小时和6小时显著受阻。透射电镜（TEM）观察到敲除细胞内病毒颗粒（红色箭头标记）数量锐减，而双链RNA（dsRNA）荧光标记证实其复制阶段受损。进一步分析显示，RPSA缺失不影响病毒吸附和内化，但导致细胞内外病毒释放量降低3.5倍，明确其作用于复制后期。

ERK1/2通路介导的脂代谢重编程机制
Western blot揭示RPSA敲除特异性抑制ERK1/2磷酸化（p-ERK1/2），而非JNK或p38通路。抑制剂U0126（40 μM）处理可模拟RPSA缺失表型，使病毒滴度下降8倍；而ERK1/2激活剂ML-098/C16-PAF能部分恢复病毒复制。RNA-seq分析发现，RPSA敲除导致脂质合成（如PCK1、ACSM3）和转运（APOC3、MTTP）相关基因表达异常，伴随胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量下降50%。共聚焦显微镜显示，感染12小时后脂滴（LDs）形成减少，而游离脂肪酸（FFAs）水平不变，提示RPSA通过ERK1/2调控脂质代谢微环境以支持病毒复制。

跨冠状病毒属的广谱抗病毒潜力
研究意外发现RPSA敲除下调氨基肽酶N（APN）表达——TGEV和PDCoV的关键受体。实验证实RPSA缺失使这两种冠状病毒滴度降低10²倍，且ERK1/2磷酸化同步减弱。值得注意的是，GII-a亚型毒株PEDV-HCHL同样依赖RPSA，暗示该机制在变异株中的保守性。

转化医学价值与未来方向
该研究首次阐明RPSA-ERK1/2-脂代谢轴在冠状病毒复制中的核心作用，突破传统受体研究的局限。鉴于RPSA在人类与猪之间的高度保守性（序列相似性>95%），其调控网络可能为包括SARS-CoV-2在内的冠状病毒提供新型广谱靶点。未来研究可探索小分子抑制剂靶向RPSA-脂代谢交互界面，或结合基因编辑技术培育抗病猪种。

（注：全文严格依据原文实验数据归纳，未添加非文献支持内容）