基于分裂绿色荧光蛋白系统的大肠杆菌表面展示CAL-B的效率优化研究

为解决大分子蛋白质在细菌表面展示效率低下的问题，研究人员创新性地采用分裂绿色荧光蛋白(split GFP)系统，将CAL-B(南极假丝酵母脂肪酶B)与Lpp-OmpA(脂蛋白-外膜蛋白A)融合表达于大肠杆菌表面。通过GFP1-10与GFP11片段的自组装实现荧光恢复，证实该策略能显著提升大分子蛋白的展示效率并保持酶活性，为复杂蛋白的表面展示提供了新思路。

　　

在微生物工程领域，如何将功能性蛋白质高效展示于细胞表面始终是制约生物传感器、环境修复等应用的关键瓶颈。传统方法面临一个尴尬困境：当目标蛋白分子量超过某个阈值时，穿越细胞膜的运输效率就会断崖式下降。这个问题在工业酶等大分子蛋白上表现得尤为突出，就像试图让大象穿过猫门——不仅困难重重，还容易造成结构损伤。

针对这一挑战，韩国弘益大学(Hongik University)化学工程系的研究团队在《Enzyme and Microbial Technology》发表创新研究。他们巧妙借鉴了自然界蛋白质自组装的智慧，将分裂绿色荧光蛋白(split GFP)系统改造为"分子胶水"，成功将工业重要的CAL-B(南极假丝酵母脂肪酶B)锚定在大肠杆菌表面。这种策略就像把大型家具拆解运输后再组装，完美避开了膜转运的尺寸限制。

研究主要采用三项关键技术：首先是分子构建技术，将16个氨基酸的GFP11片段与Lpp-OmpA膜锚定系统融合，同时将CAL-B与较大的GFP1-10片段连接；其次是荧光互补检测系统，通过自发恢复的荧光信号定量评估展示效率；最后是酶活测定，使用对硝基苯酚酯底物比较不同展示方式的催化效率。所有CAL-B基因均来自诚信女子大学Park教授实验室。

【Construction of CAL-B expression and surface display plasmids】
研究人员构建了两种表达系统：传统组直接将CAL-B融合于Lpp-OmpA的C端；实验组则采用split GFP策略，分别表达Lpp-OmpA-GFP11和CAL-B-GFP1-10。质粒设计确保两组使用相同的启动子和表达条件。

【In vitro assembly comparison】
体外实验证实，CAL-B-GFP1-10与游离GFP11的组装效率达82.3±5.1%，而与传统Lpp-OmpA直接融合的CAL-B相比，split GFP系统展示的酶活性保留率提高1.8倍。荧光强度分析显示，30kDa以下蛋白的展示效率无显著差异，但CAL-B(33kDa)的展示效率提升达2.3倍。

【Conclusions】
研究首次在细菌表面展示系统中验证了split GFP的尺寸补偿效应：对于>30kDa的蛋白，split GFP系统能突破转运瓶颈，其展示效率与蛋白尺寸呈非线性负相关。酶活检测证实该策略不仅能提高展示量，还能更好地维持蛋白功能构象。这种模块化设计为后续构建多酶复合物表面展示系统奠定了基础。

该研究的突破性在于将原本用于蛋白质互作研究的split GFP系统，创造性转化为解决膜转运尺寸限制的"分子分流器"。相比需要抗体检测的传统方法，荧光自组装特性实现了展示效率的实时监测，为高通量筛选提供了可能。值得注意的是，虽然该系统显著改善了CAL-B的展示，但研究者也指出，对于超过50kDa的超大蛋白仍需进一步优化锚定系统。这些发现为开发新一代全细胞催化剂开辟了新路径，特别是在需要多酶级联反应的生物制造领域具有重要应用前景。