基于crRNA限制性CRISPR/Cas12a系统的多重核酸检测技术cliCRISPR开发及其在SNP分型中的应用

研究人员针对CRISPR/Cas12a系统非特异性反式切割活性导致多重检测困难的问题，开发了crRNA限制性策略cliCRISPR。通过精确控制crRNA浓度实现rs4646536 SNP位点的野生型、突变型和杂合型分型，与TaqMan qPCR结果一致且符合孟德尔遗传规律，为CRISPR系统在精准医学中的应用提供了新思路。

　　

维生素D缺乏与多种疾病密切相关，而CYP27B1基因的rs4646536位点单核苷酸多态性(SNP)是影响维生素D代谢的关键遗传标记。传统SNP检测依赖PCR和测序技术，但存在设备依赖性强、操作复杂等局限。尽管CRISPR/Cas12a系统因其高灵敏度成为新兴检测工具，但其非特异性反式切割(trans-cleavage)特性导致多重检测时信号相互干扰，难以区分杂合型等复杂基因型。

郑州大学第一附属医院口腔科的研究团队在《Biosensors and Bioelectronics》发表研究，开发了crRNA限制性CRISPR/Cas12a系统（cliCRISPR）。该系统通过控制crRNA浓度（如10nM crRNA1和3nM crRNA2），使荧光强度与crRNA而非靶标浓度相关，结合逻辑门判读阈值（V₀=25.96，V₁=40.16，V₂=1815.56），成功实现rs4646536位点的三重分型。关键技术包括：1）FEN1酶介导的特异性序列识别；2）双链置换扩增(SDA)实现信号转换；3）crRNA浓度梯度优化。

【Viability validation】
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳证实，Flap primer1/2可特异性识别野生型和突变型等位基因，经FEN1酶切产生差异产物P1/P2（图S1A）。

【Section snippets】
使用10nM crRNA1和3nM crRNA2时，野生型、突变型和杂合型样本分别呈现低、中、高荧光强度，斜率分析显示三者信号增长速率比为1:1.55:69.9（图1D）。

【Conclusion】
cliCRISPR突破了传统CRISPR系统多重检测的瓶颈，在2个家系10例样本验证中与TaqMan qPCR结果完全一致。相比微流控芯片或实时动力学监测方案，该方法仅需终点荧光比较，显著降低了技术门槛。研究为CRISPR系统在SNP筛查、遗传病诊断等精准医学场景的应用提供了新范式，尤其适合基层医疗机构开展。

（注：全文细节均来自原文，专业术语如FEN1（flap endonuclease 1）、SDA（strand displacement amplification）等首次出现时已标注解释，作者署名保留原文格式Bo Yan等，机构名称按国内规范翻译）