基于双信号放大技术(PER-HCR)的电化学生物传感器用于ctDNA中BRAF突变的超灵敏痕量检测

为解决黑色素瘤早期诊断中BRAF突变检测灵敏度不足的难题，研究人员开发了基于引物交换反应(PER)和杂交链式反应(HCR)的双信号放大电化学生物传感器。该技术通过级联放大将检测限降至0.34 fM，线性范围跨越5个数量级(0.01 pM-1 nM)，在血清样本中展现出卓越的特异性和稳定性，为临床低丰度核酸检测提供了新策略。

　　

黑色素瘤作为最具侵袭性的皮肤恶性肿瘤，其早期诊断直接决定患者生存率。而BRAF基因突变存在于50%的黑色素瘤病例中，成为关键的分子标志物。然而传统检测方法如Sanger测序和qPCR面临灵敏度不足（仅能检测pM级）、操作繁琐等瓶颈，难以满足临床对痕量循环肿瘤DNA(ctDNA)的检测需求。

南通大学附属第六医院（江苏省盐城市第三人民医院）临床检验科的蔡爱婷、鞠慧香团队在《Bioelectrochemistry》发表研究，创新性地将引物交换反应(PER)和杂交链式反应(HCR)两种等温扩增技术级联，构建了PER-HCR-MB电化学生物传感器平台。该研究通过金电极表面探针捕获目标DNA后，依次触发PER产生多重复片段，进而启动HCR形成大量携带甲基蓝(MB)标记的双链结构，实现信号的双重放大。关键技术包括：电极表面Au-S键固定捕获探针、Bst DNA聚合酶介导的PER扩增、发卡结构H2/H3的HCR自组装，以及方波伏安法(SWV)信号检测。

【化学试剂和材料】
研究采用TCEP处理硫醇化DNA探针，通过MCH封闭电极非特异性位点。关键试剂包括Bst 2.0 DNA聚合酶、dNTPs混合物，以及经HPLC纯化的所有寡核苷酸序列。

【PER-HCR-MB电化学生物传感器原理】
当存在BRAF突变体时，捕获探针-靶标复合物激活启动子1，引导H1在Bst聚合酶作用下生成含20个重复单元的单链产物。这些重复序列进一步结合启动子2，触发H2/H3发卡交替打开并自组装成长双链，末端MB分子产生显著电化学信号。

【结论】
相比单一扩增技术（PER 1.27 pM或HCR 0.23 pM），双信号放大策略将检测限降低3个数量级至0.34 fM。在10%血清环境中仍保持优异性能，回收率达95.6%-104.3%。该平台兼具宽线性范围、高特异性（可区分单碱基突变）和30天长期稳定性，为临床肿瘤基因检测提供了超灵敏、低成本的新方法。

研究团队特别指出，这种模块化设计可适配其他核酸靶标检测，通过更换探针序列即可应用于不同癌症的分子诊断。该成果获得江苏医药职业学院校地合作项目(20239125)和盐城市卫健委科研项目(YK2023090)的资助，为精准医疗提供了重要的技术支撑。