综述：CRISPR-Cas基因组编辑在人类治疗中的脱靶效应：进展与挑战

这篇综述深入探讨了CRISPR-Cas系统在基因治疗中的脱靶效应（OTA），系统梳理了gRNA设计、脱靶位点预测和检测技术的最新进展，并提出了包括高保真Cas变体（HF-Cas）、碱基编辑（BE）和先导编辑（PE）在内的多种解决方案。作者强调标准化检测流程和功能验证对临床转化的重要性，为基因编辑疗法的安全性评估提供了全面指导。

　　

CRISPR-Cas基因组编辑工具箱

CRISPR-Cas系统通过向导RNA（gRNA）引导Cas核酸酶在特定位点产生双链断裂（DSB），随后细胞通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）途径进行修复。NHEJ易产生插入/缺失（indels），而HDR可实现精确修复。此外，微同源介导的末端连接（MMEJ）会导致更大范围的缺失。近年来发展的碱基编辑（BE）和先导编辑（PE）技术通过避免DSB形成，显著降低了脱靶风险。

脱靶效应的机制与风险

脱靶效应源于gRNA与非完全匹配序列的结合，可能引发基因功能破坏或致癌突变。除局部indels外，结构性变异（SV）如染色体易位和大片段缺失更具危害性。影响因素包括gRNA序列特异性、Cas变体选择（如SpCas9对NGG-PAM的依赖）、细胞类型和递送方式。

脱靶检测技术进展

计算预测工具：CRISPRme等工具结合群体遗传变异数据提升预测准确性；实验验证方法：

• 体外检测：Digenome-seq通过全基因组测序捕获Cas9切割位点
• 细胞检测：GUIDE-seq利用双链标签标记DSB，DISCOVER-seq通过MRE11富集切割位点
  
  

临床转化挑战与解决方案

针对β-血红蛋白病（如镰刀型贫血）的临床试验（如Casgevy）展示了gRNA优化和个体化分析的重要性。建议采用五步法：

1. 基于能量模型设计高特异性gRNA
2. 多组学方法验证脱靶位点
3. 长读长测序检测结构性变异
4. 体外致瘤性评估（如软琼脂实验）
5. 符合GMP标准的规模化生产

未来需开发更灵敏的SV检测技术，并建立跨研究平台的标准化评估体系，以推动基因编辑疗法的安全应用。