pH敏感型明胶/海藻酸钠复合微球的可控制备及其白藜芦醇递送潜力研究

为解决传统酵母发酵过程中风味物质调控不足的问题，研究人员利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑酿酒酵母(S. cerevisiae)的CAR1基因，发现精氨酸酶失活可显著提升热带水果香(isoamyl alcohol)和花香(phenethyl alcohol)物质产量，为食品饮料行业风味精准调控提供了新策略。

　　

在食品工业领域，如何精准调控发酵产物的风味特征一直是困扰研究者的难题。传统诱变育种方法效率低下，而外源基因导入又面临严格的监管限制。更棘手的是，发酵过程中产生的氨基甲酸乙酯(EC)等致癌物存在安全隐患。这些矛盾促使科学家们探索更精准、安全的基因编辑方案。

首尔国立大学国际农业技术研究生院的研究团队独辟蹊径，将目光聚焦于精氨酸代谢的关键酶——精氨酸酶(CAR1)。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，他们在三种不同遗传背景的酿酒酵母(S. cerevisiae)中构建了两种CAR1突变体：完全敲除(ΔCAR1)和提前终止密码子插入(Gln26stop)。令人惊喜的是，这种精准编辑不仅降低了EC前体尿素含量，还意外发现了风味增强效应。

研究采用了两大关键技术：一是体外转录sgRNA与质粒表达Cas9的CRISPR编辑体系，通过同源重组实现精准突变；二是结合顶空固相微萃取箭头(HS-SPME-Arrow)与气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术，对挥发性有机物(VOCs)进行定量分析。实验设置了严格的对照组，包括野生型菌株和两种突变体，所有菌株均来自传统韩国发酵食品分离株或标准保藏菌种(KCCM 51299)。

研究结果部分揭示了多项重要发现：

3.1 S. cerevisiae KCCM 51299 ΔCAR1和Gln26stop突变体风味分析
GC-MS数据显示，两种突变体均使isoamyl alcohol(热带水果香)和phenethyl alcohol(玫瑰香)产量提升30-80%，而中链脂肪酸及其乙酯含量显著降低。代谢通路分析表明，CAR1失活可能通过重定向氮代谢流量影响风味物质合成。

3.3 CRISPR/Cas9编辑CAR1突变体的筛选与鉴定
创新性采用150 mg/L刀豆氨酸(CAO)选择培养基，结合MseI限制性酶切和Sanger测序验证，成功分离出纯合突变体。电泳结果显示ΔCAR1菌株PCR产物缩短约1 kb，Gln26stop突变则引入特异性TTAA酶切位点。

3.5 野生型与CRISPR编辑菌株的发酵性能
在100 g/L葡萄糖的YPD培养基中，突变体与野生型的生长曲线和乙醇产量无显著差异，证实CAR1编辑不影响基础发酵功能。SNUws菌株的Gln26stop突变体甚至表现出轻微的生长优势。

3.6 风味化合物的GC-MS分析
三株工程菌均呈现一致性变化：SNUws菌株的isoamyl alcohol从243.04 mg/L增至315.52 mg/L(ΔCAR1)和312.95 mg/L(Gln26stop)；phenethyl alcohol增幅更显著，达79.5%和44.7%。这种跨菌株的重复性证实了CAR1调控的普适性。

讨论部分深入阐释了该研究的双重价值：在应用层面，通过单基因编辑同时实现风味增强和毒素控制，为发酵食品安全生产提供了范例。CAR1失活导致的代谢流重编程，使支链氨基酸(亮氨酸、苯丙氨酸)降解增强，进而提升相应高级醇产量。在机制层面，研究首次揭示了精氨酸代谢与挥发性风味物质合成的未知关联，为酵母代谢网络研究开辟了新视角。

值得注意的是，研究者采用体外转录sgRNA的策略规避了质粒残留风险，这种"无痕编辑"方式更符合食品工业的监管要求。随着欧盟等地区对基因编辑作物的政策松绑，这项技术有望快速转化为产业优势。论文发表在食品科技领域权威期刊《LWT》上，为代谢工程与食品安全的交叉研究提供了重要范例。未来研究可进一步解析CAR1缺失影响脂肪酸合成的分子机制，并探索动态调控策略以实现风味的精准定制。