ASB8介导的ERβ泛素化下调促进肺腺癌淋巴结转移的分子机制及临床意义

本研究揭示了雌激素受体β(ERβ)通过CCL15-CCR1轴招募肿瘤相关中性粒细胞(TANs)促进肺腺癌(LUAD)淋巴结转移的新机制。研究人员发现E3泛素连接酶ASB8通过K48连接的多聚泛素化降解ERβ，而低ASB8表达导致ERβ稳定性增加，进而激活CCL15-CCR1-ERK-VEGFC信号通路，促进淋巴管生成和转移。该研究为LUAD转移提供了新的治疗靶点。

　　

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中肺腺癌(LUAD)是最常见的亚型。尽管手术、靶向治疗和免疫治疗取得了进展，但复发和转移仍是主要挑战。淋巴结(LN)转移是LUAD扩散的主要途径，临床预后很大程度上取决于局部淋巴结受累程度。研究表明，原发性LUAD部位的淋巴管密度与淋巴结转移呈正相关。雌激素受体β(ERβ)作为雌激素信号通路的关键组分，在肺癌进展、转移和EGFR-TKI(表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂)耐药中起重要作用。然而，ERβ蛋白在淋巴结转移性LUAD中高表达的机制及其在促进淋巴结转移中的具体作用尚不清楚。

华中科技大学同济医学院附属协和医院的研究人员开展了一项深入研究，揭示了ERβ通过调控肿瘤相关中性粒细胞(TANs)促进肺腺癌淋巴结转移的分子机制。研究发现ERβ通过转录上调CCL15表达，进而通过CCR1受体招募中性粒细胞，这些中性粒细胞分泌VEGFC促进淋巴管生成。此外，研究首次发现E3泛素连接酶ASB8通过K48连接的多聚泛素化降解ERβ，而ASB8在淋巴结转移性LUAD中低表达导致ERβ蛋白稳定性增加。该研究为理解LUAD淋巴结转移提供了新的理论依据，并为开发针对ERβ和ASB8的治疗策略指明了方向。相关成果发表在《Cell Death and Disease》杂志上。

研究人员采用了多种关键技术方法：通过免疫组化分析44例LUAD临床样本中ERβ表达；利用CIBERSORT算法分析TCGA-LUAD转录组数据中的免疫细胞浸润；建立原位肺癌小鼠模型研究淋巴结转移；采用Co-IP(免疫共沉淀)和泛素化实验验证ASB8与ERβ的相互作用；通过流式细胞术分析中性粒细胞凋亡；使用荧光素酶报告基因检测ERβ对CCL15启动子的调控作用。

ERβ与肺腺癌淋巴管形成和淋巴结转移相关
临床样本分析显示，ERβ在淋巴结转移性LUAD组织中表达显著升高，且与微淋巴管密度(MLD)增加相关。体外实验发现，ERβ过表达并不直接影响人淋巴内皮细胞(HLEC)的管形成能力，提示ERβ可能通过其他微环境细胞间接影响淋巴管生成。

ERβ正向调控中性粒细胞趋化性
通过TCGA-LUAD数据分析和免疫荧光染色，研究发现ERβ表达与CD66b⁺中性粒细胞浸润呈正相关。体外趋化实验证实，ERβ过表达的肿瘤细胞条件培养基能显著增强中性粒细胞趋化性，而ERβ敲低则抑制这一效应。此外，ERβ还能抑制中性粒细胞凋亡。

ERβ通过TANs促进LUAD淋巴管生成和淋巴结转移
小鼠实验中，使用抗Ly6G抗体清除中性粒细胞可逆转ERβ诱导的转移。ERβ过表达组表现出更大的纵隔淋巴结和更高的转移率，这些效应在中性粒细胞清除后被抑制。免疫荧光显示，ERβ过表达组中MPO⁺中性粒细胞浸润和LYVE1⁺淋巴管密度增加，而中性粒细胞清除后这些效应被逆转。

ERβ通过CCL15-CCR1轴招募中性粒细胞
转录组测序发现ERβ上调CCL15表达。ChIP-qPCR证实ERβ直接结合CCL15启动子区。使用CCL15中和抗体可阻断ERβ介导的中性粒细胞招募。小鼠实验中，CCR1拮抗剂BX471能抑制ERβ诱导的纵隔转移，减少肿瘤中Ly6G⁺CD11b⁺中性粒细胞数量。

中性粒细胞来源的VEGFC对淋巴管生成至关重要
研究发现，受ERβ条件培养基刺激的中性粒细胞高表达VEGFC和VEGFD。ELISA证实中性粒细胞产生的VEGFC水平高于肿瘤细胞本身。临床样本中，ERβ高表达的组织中VEGFC⁺MPO⁺细胞比例更高。

CCL15-CCR1轴对中性粒细胞介导的淋巴管生成至关重要
机制研究表明，LUAD来源的CCL15通过CCR1激活ERK磷酸化，进而上调VEGFC表达。ERK1/2激动剂Ro 67-7476增加VEGFC产生，而抑制剂PD98059则抑制这一效应。CCL15中和或CCR1抑制均能损害HLEC管形成。

鉴定ERβ调节因子ASB8
研究发现E3泛素连接酶ASB8在淋巴结转移性LUAD组织中低表达。ASB8与ERβ存在内源性和外源性相互作用。ASB8敲低增加ERβ蛋白水平但不影响ESR2基因表达。氯喹抑制实验表明ASB8诱导的ERβ降解不依赖溶酶体途径。环己酰亚胺追踪实验显示ASB8过表达显著缩短ERβ蛋白半衰期，而蛋白酶体抑制剂MG132可部分逆转这一效应。

ASB8诱导ERβ的K48连接多聚泛素化
泛素化实验证实ASB8以剂量依赖方式增强ERβ多聚泛素化，缺失SOCS结构域(dSOCS)则消除这一效应。进一步分析显示ASB8主要诱导ERβ的K48连接多聚泛素化，促进其通过蛋白酶体降解。

ASB8过表达破坏ERβ稳定性，抑制CCL15和VEGFC分泌及淋巴管生成
实验表明ASB8过表达可逆转oeERβ细胞通过中性粒细胞促进的淋巴管生成。ELISA显示ASB8过表达降低oeERβ-CM中的CCL15水平和中性粒细胞上清中的VEGFC水平，而重新引入外源ERβ可恢复这些效应。中性粒细胞趋化能力在ASB8过表达的oeERβ-CM中显著降低，但外源ERβ可恢复这一功能。

ERβ药理抑制减弱体内中性粒细胞招募和淋巴转移
在原位肺癌模型中，ERβ激动剂DPN显著促进纵隔转移，而拮抗剂PHTPP有效对抗这些效应。PHTPP治疗减少肿瘤相关Ly6G⁺CD11b⁺中性粒细胞数量，同时使MLD正常化。多中心队列生物信息学分析证实ESR2是LUAD的重要预后生物标志物，高表达预示较差的总生存期。

该研究揭示了ERβ-CCL15-CCR1-VEGFC通路在TANs相关淋巴管生成和淋巴结转移中的作用，阐明了ASB8通过K48连接多聚泛素化调控ERβ蛋白稳定性的新机制。这些发现不仅拓展了对LUAD转移机制的认识，还为开发针对ERβ和ASB8的治疗策略提供了理论依据。特别是，直接靶向ERβ信号可达到与CCR1抑制相当的抗转移效果，这为拦截LUAD转移级联反应提供了新的治疗靶点。临床相关性分析进一步强化了ERβ促进转移进展的实验发现，使其成为潜在的预后生物标志物和治疗靶点。