人血清白蛋白衍生生物传感器NBD-DAH：可视化癌细胞中铜(II)与硫化氢互作调控氧化还原平衡的新工具

本研究针对肿瘤微环境中Cu2+和H2S动态监测难题，开发了基于人血清白蛋白铜结合位点的肽类荧光探针NBD-DAH。该探针通过"开-关-开"荧光响应实现Cu2+(检测限40.6 nM)与H2S(检测限12.3 nM)的序贯检测，首次揭示了H2S通过螯合Cu2+抑制SOD1活性调控肿瘤氧化还原平衡的分子机制，为肿瘤诊疗提供了新型可视化工具。

　　

在肿瘤生物学领域，铜离子(Cu²⁺)和硫化氢(H₂S)如同神秘的"双面特工"——它们既是维持生命活动的重要分子，又在肿瘤发生发展中扮演着矛盾角色。Cu²⁺既能促进血管生成和肿瘤转移，又能诱导细胞程序性死亡；H₂S则表现出浓度依赖性效应，低浓度促癌而高浓度抑癌。这种复杂的生物学行为使得实时监测它们在癌细胞中的动态变化成为肿瘤诊断和治疗评估的关键。然而，传统检测方法如原子吸收光谱和高效液相色谱虽能准确量化，却无法提供时空信息；现有荧光探针又难以克服肿瘤微环境（弱酸性胞外pH 6.8 vs 碱性胞内环境）的干扰。更关键的是，Cu²⁺与H₂S的相互作用如何影响肿瘤氧化还原平衡，始终缺乏直观的研究工具。

针对这些挑战，甘肃中医药大学第一临床医学院的研究团队从人血清白蛋白(HSA)的天然铜结合位点获得灵感，创新性地开发了水溶性肽类荧光探针NBD-DAH。这项发表在《Journal of Advanced Research》的研究，通过仿生设计实现了癌细胞中Cu²⁺-H₂S相互作用的可视化，并首次阐明了其通过调控超氧化物歧化酶1(SOD1)活性影响氧化还原平衡的分子机制。

研究人员主要运用了以下关键技术：基于固相肽合成法构建NBD标记的Asp-Ala-His三肽探针；通过紫外-可见光谱、荧光寿命和量子产率测定分析探针性能；结合分子对接和密度泛函理论(DFT)计算验证结合位点；采用TEM和动态光散射表征纳米结构变化；建立前列腺癌RM-1细胞模型和斑马鱼胚胎进行活体成像；通过SOD1活性检测和Western blotting分析氧化应激通路。

合成与表征
NBD-DAH通过模仿HSA氮末端Cu²⁺结合位点DAH基序设计，质谱显示[分子量+Cu²⁺]峰569.19证实1:1结合模式。DFT计算揭示结合能达-134.298 kJ/mol，电子从组氨酸咪唑基团向Cu²⁺中心转移，形成配体-金属电荷转移(LMCT)导致荧光猝灭。

特异性与灵敏度
探针对Cu²⁺的识别常数达3.4×10⁸ M^-1，在pH 5-11范围内稳定工作。Cu²⁺使荧光寿命从1.40 ns延长至2.80 ns，而S^2-通过形成溶度积更低的CuS(K_sp=6.3×10^-36)使荧光恢复，该过程可逆循环7次无信号衰减。

分子机制解析
FT-IR显示咪唑C=N键振动峰从1647 cm^-1红移至1627 cm^-1，证实Cu²⁺与咪唑氮配位。TEM观察到Cu²⁺诱导探针纳米颗粒聚集(164→187 nm)，而S^2-使其解聚。

生物应用验证
在RM-1癌细胞中，NBD-DAH成功捕获到Cu²⁺流入引发的荧光猝灭及后续S^2-恢复信号。流式细胞术证实S^2-能逆转Cu²⁺诱导的ROS升高，Western blotting显示SOD1活性被抑制42.7%，但蛋白表达量不变。

活体成像突破
肿瘤模型实验显示，瘤内注射探针后10分钟内即可响应Cu²⁺信号变化，NaHS处理后荧光恢复。H&E染色证实探针在4 mM剂量下对主要器官无毒性。

这项研究不仅提供了监测肿瘤微环境Cu²⁺-H₂S动态的强大工具，更揭示了气体信号分子通过金属离子螯合调控抗氧化酶活性的新机制。NBD-DAH的广谱pH适应性和可逆检测特性，使其在肿瘤精准诊疗领域展现出独特优势。特别值得注意的是，该工作首次通过分子影像证实了H₂S可通过"劫持"Cu²⁺影响SOD1功能，这为理解肿瘤氧化应激调控网络提供了全新视角，也为开发基于铜离子稳态调控的抗癌策略奠定了理论基础。