柑橘属植物保守着丝粒寡核苷酸序列的染色体涂绘揭示其核型高度相似性

本研究为解决柑橘属植物着丝粒标记开发难题，通过结合ChIP-seq数据与高质量甜橙基因组(SWO v3)，筛选出16,827个45-nt着丝粒特异性寡核苷酸探针。研究团队成功开发出能特异性识别1号和4号染色体着丝粒的探针(Chr1-Cen/Chr4-Cen)，通过双色FISH验证其在6个柑橘属及近缘种中的保守性，揭示了柑橘着丝粒单拷贝序列的进化稳定性，为柑橘细胞遗传学和着丝粒演化研究提供了新工具。

　　

柑橘作为全球最重要的经济果树之一，其染色体研究长期受制于着丝粒标记的缺乏。传统CMA/DAPI染色和重复序列FISH探针存在种属特异性强、分辨率不足等问题，尤其难以区分单个染色体的着丝粒。更棘手的是，柑橘着丝粒区域富含高度变异的重复序列，先前基于甜橙基因组SWO v2的定位结果出现多峰现象，反映出基因组组装不完整带来的技术瓶颈。

华中农业大学园艺林学学院园艺作物种质创新与利用全国重点实验室的研究人员另辟蹊径，利用新发布的SWO v3基因组重新解析CsCENH3的ChIP-seq数据，首次在9条染色体上精确定位出单一着丝粒区域（大小0.75-4.51 Mb）。通过Chorus2算法筛选出16,827个45-nt单拷贝寡核苷酸，以每kb 0.84-1.51个探针的密度构建着丝粒特异性标记库。研究团队随机选取1号（Chr1-Cen）和4号染色体（Chr4-Cen）的2,179个寡核苷酸合成探针，在《Horticulture Advances》发表了这项突破性成果。

关键技术包括：1) 基于SWO v3基因组重新定位CsCENH3结合区域；2) 采用20 kb滑动窗口筛选单拷贝45-nt寡核苷酸；3) 双色FISH与着丝粒重复序列标记CL34contig88共定位验证；4) 对柑橘属4个物种及近缘属2个物种进行跨物种染色体涂绘分析。

主要研究结果
Identification of centromere-specific oligos
通过比较SWO v3与SWO v2的ChIP-seq数据比对率（90.38% vs 72.57%），证实新基因组组装显著提升着丝粒定位精度。Chr4着丝粒区域（14.41-15.38 Mb）首次被准确定位，修正了先前遗漏3.09%染色体长度的误差。

Validation of the centromeric regions targeted by oligo probes
双色FISH显示Chr1-Cen（Fam标记）和CL34contig88（四甲基罗丹明标记）在'红橘'有丝分裂染色体上完全共定位，且仅靶向1对同源染色体。减数分裂粗线期观察证实探针能在配对染色体上产生单一信号，与生物信息学预测高度吻合。

The oligo sequences in the centromeres are conserved in Citrus and its related genera
跨物种实验表明，基于甜橙设计的探针在柚（C. grandis）、柠檬（C. limon）乃至金柑属（Fortunella）、枳属（Poncirus）中均保持特异性，揭示着丝粒单拷贝序列在数百万年进化中的惊人保守性。

Different citrus species exhibited a comparable karyotype
核型分析显示所有测试物种的1号染色体均为亚中着丝粒（臂比1.70-1.90），4号染色体为正中着丝粒（臂比1.25-1.34），证实柑橘染色体形态的进化稳定性。

这项研究首次实现柑橘单个染色体着丝粒的特异性识别，突破传统重复序列标记的局限性。着丝粒寡核苷酸探针兼具全染色体涂绘的稳定性和区域标记的经济性，为柑橘属细胞遗传学提供普适性工具。特别值得注意的是，尽管着丝粒重复序列在柑橘属内呈现高度变异，但单拷贝寡核苷酸却展现出跨物种保守性，这为理解着丝粒"功能保守-序列分化"的进化悖论提供了新视角。研究建立的Chr1-Cen/Chr4-Cen标记系统，将助力柑橘远缘杂交中的染色体行为追踪、多倍体形成机制解析等重大科学问题的攻克。