白色念珠菌metacaspase蛋白N端结构域在钙离子结合中的调控机制研究

本研究针对致病真菌白色念珠菌中I型metacaspase（CaMCA-Ia）的激活机制展开探索，通过构建N端截短突变体（CaMCA-Ia-ΔN86）及钙结合位点突变体，揭示了N端86个氨基酸通过改变钙离子（Ca2+）结合亲和力调控多步骤自剪切成熟的分子机制，为抗真菌药物靶点开发提供新思路。

　　

在真菌感染治疗领域，白色念珠菌作为常见致病菌，其耐药性问题日益严峻。这类病原体的生存依赖一类特殊蛋白酶——metacaspase（ metacaspase），它们与哺乳动物caspase（ caspase）结构相似但功能独特，尤其对钙离子的响应机制长期未明。现有研究显示，I型与II型metacaspase的N端结构存在显著差异，但N端如何影响钙依赖性激活过程仍是未解之谜。

为破解这一科学问题，来自巴西圣保罗大学（Universidade de S?o Paulo）的研究团队以白色念珠菌I型metacaspase CaMCA-Ia为研究对象。该蛋白具有典型的Ca²⁺依赖性自剪切特性，其N端呈现独特疏水性特征。研究人员发现，天然CaMCA-Ia在表达纯化过程中主要存在55 kDa未剪切（E1）和40 kDa中间体（E2）两种形式，而完全成熟形式（E3）需经5 mM CaCl₂长时间诱导才能获得。这种多步骤成熟过程暗示着复杂的钙离子调控机制。

研究采用三大关键技术：1）分子克隆构建全长及N端截短86个氨基酸的突变体（CaMCA-Ia-ΔN86）；2）定点突变钙结合位点关键天冬氨酸（D252A/D268A/D299A等）；3）钙离子浓度梯度实验结合SDS-PAGE动态监测蛋白剪切过程。

【Cloning of CaMCA-Ia complete and truncated form】
通过合成基因与PCR技术，团队成功构建了pET28(a)+载体表达系统。值得注意的是，截短突变体CaMCA-Ia-ΔN86的引物设计精确移除了编码N端86个氨基酸的序列，为后续功能比较奠定基础。

【Results and discussion】
实验揭示三个关键发现：首先，截短突变体呈现渐进式自剪切模式，其分子间激活能力类似哺乳动物caspase；其次，钙离子可诱导多步剪切并加速成熟过程；最重要的是，全长与截短蛋白的钙结合位点存在显著差异，证实N端通过变构效应调节Ca²⁺亲和力。天冬氨酸突变体实验显示，D268/299A双突变体需48小时才出现剪切现象，说明这些位点对钙响应至关重要。

【Conclusions】
该研究首次阐明CaMCA-Ia的N端通过调控钙结合亲和力影响其自剪切动力学：1）N端缺失导致钙依赖性激活模式改变；2）D268/D299等关键氨基酸构成钙结合位点；3）多步剪切过程存在快慢两种模式。这些发现不仅完善了metacaspase的激活理论，更揭示N端结构域可作为抗真菌药物设计的特异性靶点。论文发表于《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics》，为开发针对病原真菌钙信号通路的新型抑制剂提供了分子基础。