转座子插入CmKNAT2-like2基因破坏甜瓜斑驳果皮形成的分子机制解析

本研究揭示了甜瓜(Cucumis melo L.)果皮斑纹形成的关键遗传机制。为解决斑驳果皮性状的分子基础问题，青岛农业大学等团队通过构建近等基因系(NILs)和EMS诱变材料，结合图位克隆技术，发现CACTA型TIR转poson插入CmKNAT2-like2基因导致其核定位和二聚化功能缺陷，进而通过调控叶绿体发育相关基因表达影响斑纹形成。该研究不仅克隆了控制甜瓜重要外观性状的CmMt2位点，还为理解转座子驱动作物表型多样性提供了新案例。

　　

甜瓜作为全球重要的经济作物，其果实外观品质直接影响消费者选择。斑驳果皮作为甜瓜最显著的外观特征之一，其形成机制长期困扰着育种学家。尽管前人研究发现CmMt1和CmMt2两个位点共同调控该性状，但CmMt2的分子身份及其作用机制始终是未解之谜。更令人困惑的是，自然群体中斑纹表型与基因型的对应关系存在明显例外，暗示可能存在未被发现的遗传变异。这些知识缺口严重制约了甜瓜外观性状的精准育种。

青岛农业大学园艺学院的研究团队通过创新性的遗传材料设计，揭开了这一谜题。研究者以非斑纹品系'13C'为轮回亲本，分别与野生斑纹材料'PI14'和EMS诱变获得的显性斑纹突变体'S249'杂交，构建了两套互补的遗传群体。通过整合MutMap+定位、图位克隆和群体基因组分析，最终在染色体2末端44-kb区间锁定关键变异——一个4,231bp的CACTA型TIR转座子插入。该插入导致KNOX家族转录因子CmKNAT2-like2丢失ELK和Homeodomain结构域，实验证实这种结构变异会破坏蛋白的核定位和二聚化能力。CRISPR/Cas9敲除实验进一步验证了该基因的功能必要性。转录组分析揭示突变体通过影响叶绿体发育和叶绿素合成相关基因表达（如HEME、UROD、CPO等）导致表型变异。对650份种质的群体分析显示，该转座子插入与栽培甜瓜的非斑纹表型显著相关，暗示其在驯化过程中可能受到选择。这项发表于《Horticulture Research》的研究首次解析了转座子通过修饰转录因子调控作物外观图案的完整分子路径。

关键技术方法包括：1）利用'13C'×'PI14'和'13C'×'S249'群体进行图位克隆；2）基于'13C'基因组组装的MutMap+分析；3）CRISPR/Cas9基因编辑构建敲除株系；4）酵母双杂交(Y2H)和pull-down检测蛋白互作；5）透射电镜(TEM)观察叶绿体超微结构；6）对650份自然种质进行转座子基因分型。

精细定位揭示关键区间
通过NILs群体将CmMt2初步定位到3Mb区域，进一步利用重组单株将区间缩小至275kb。与此同时，对'S249'突变体的MutMap+分析独立定位到300kb重叠区域，两者交集锁定44-kb关键区间，包含6个候选基因。序列比对发现'13C'在该区间存在4,231bp转座子插入，该插入被验证为CACTA型TIR转座子。

CmKNAT2-like2的功能验证
转座子插入导致MELO3C026289（命名为CmKNAT2-like2）转录本缩短222bp。系统发育分析显示该基因属于KNAT2/6亚家族。通过构建靶向该基因的CRISPR/Cas9载体转化斑纹材料'PI47'，获得的两个突变体（cr-1和cr-2）均表现为非斑纹表型，证实其功能必要性。

结构变异导致功能缺陷
比较'13C'和'S249'的蛋白结构发现，转座子插入导致CmKNAT2-like2丢失ELK（核定位）和Homeodomain（DNA结合）结构域。亚细胞定位显示突变蛋白丧失核定位能力，Y2H和pull-down实验证实其二聚化能力显著降低。这些证据共同解释了转座子如何通过结构破坏使转录因子失活。

叶绿体发育的调控网络
TEM显示'S249'表皮细胞含有更多且结构紧密的叶绿体。转录组分析发现斑纹与非斑纹组织间有334个共同差异基因，显著富集于光合作用和叶绿素合成通路（如HEME、UROD、CPO等9个关键基因），表明CmKNAT2-like2通过调控质体发育影响斑纹形成。

群体遗传与驯化选择
GWAS在CmKNAT2-like2附近检测到显著信号。对250份有表型记录的种质分析显示，68.68%无转座子插入材料表现为斑纹表型，而72.06%携带转座子的材料为非斑纹表型，表明该变异在栽培种中受到选择。

这项研究首次阐明转座子通过精确插入改变转录因子功能模块，进而调控下游叶绿体发育通路最终影响果实外观的分子机制。不仅解决了甜瓜遗传育种中的关键问题，为分子标记辅助选择提供了靶点，更重要的是揭示了转座子作为"基因组雕塑家"如何通过结构变异驱动作物表型多样性的新范例。该发现对理解园艺作物复杂图案的进化具有普遍意义，为利用转座子特性进行作物改良提供了理论依据。