甲醇固定与RNA/DNA杂交体直接标记技术实现单细胞全长转录组测序

这篇研究创新性地结合甲醇固定与原位反转录技术，开发了单细胞全长转录组测序新策略（scFL）。通过优化甲醇浓度（40%）和引入甲醛二次固定，解决了传统方法（如Smart-seq）通量低、3'-端测序信息不全的瓶颈，首次实现RNA/DNA杂交体直接转座（Tn5介导），在GM12878、HEK293T和NIH/3T3细胞中验证了全长转录本捕获能力，为可变剪接分析和单细胞多组学研究提供了新工具。

　　

甲醇固定实现细胞完整性与RNA保护

研究团队发现80%甲醇固定能有效维持GM12878、HEK293T和NIH/3T3细胞的RNA完整性（RIN>8.7），同时保持细胞形态。通过对比体外与原位反转录实验，证实甲醇的膜渗透特性使oligo-dT₃₀VN引物和逆转录酶顺利进入细胞，生成500-5000 bp的全长cDNA，且细胞经处理后仍保持完整结构。

低浓度甲醇优化提升转录本捕获效率

将甲醇浓度降至40%后出现关键突破：基因组外显子区域比对率提升至85%，与常规RNA-seq数据相关性（Pearson R>0.9）显著优于高浓度组。这源于低浓度甲醇选择性渗透细胞膜而不破坏核膜，减少基因组DNA干扰。转座缓冲液中添加12.5% DMF和11.25% PEG8000，使Tn5对RNA/DNA杂交体的切割效率提升3倍。

甲醛二次固定解决单细胞平台适配难题

在10X Genomics单细胞ATAC-seq平台应用中，首次发现甲醇固定细胞在微流控分选时易破裂，导致物种混合实验中交叉污染率达42%。引入0.1%甲醛二次固定后，单次实验捕获细胞数从5,330提升至10,563，HEK293T/NIH/3T3双细胞率降至0.25%以下。该优化使单细胞基因检出量达Microwell-seq2水平（约3000基因/细胞）。

全长覆盖揭示可变剪接事件

在NIH/3T3细胞中，伪bulk数据与标准RNA-seq的剪接位点一致性达92%。以Cct5基因为例，单细胞数据不仅重现了所有已知剪接变体（SE事件），还能量化各亚型比例（如外显子跳跃频率与bulk数据偏差<15%）。测序深度>50,000 reads/cell时，可检测到TPM>16的低丰度异构体。

技术局限与未来方向

当前方法在原发性细胞中仍面临RNA降解挑战，可能需引入RNase抑制剂。Tn5对双链DNA的偏好性导致低表达基因检出灵敏度不足，研究建议尝试滚环扩增（RCA）补偿。该技术为阿尔茨海默症等涉及剪接异常的疾病研究提供了新的单细胞解决方案，其"固定-标记-分选"三步策略有望拓展至空间转录组领域。