综述：CRISPR-Cas系统的近期应用、未来展望与局限性

这篇综述深入探讨了CRISPR-Cas9系统在基因组编辑中的革命性作用，重点分析了其分子机制（如HNH/RuvC结构域和PAM识别）、修复通路调控（NHEJ/HDR）及临床应用（如癌症免疫治疗）。作者系统梳理了提高编辑精度的策略（如RAD51激活剂RS-1和DNA-PK抑制剂AZD7648），并指出当前挑战（脱靶效应、免疫原性）。综述为开发下一代基因疗法提供了关键见解。

　　

引言

CRISPR-Cas系统从细菌的适应性免疫机制蜕变为基因组编辑的"分子剪刀"，其核心在于Cas9蛋白与向导RNA(gRNA)的协同作用。通过靶向诱导DNA双链断裂(DSB)，该系统可精确修正致病突变或调控基因功能，效率远超锌指核酸酶(ZFNs)等传统工具。

CRISPR-Cas9的分子架构

Cas9蛋白由识别(REC)和核酸酶(NUC)两个功能叶组成。REC叶的REC1/REC2结构域负责gRNA结合和构象调节，而NUC叶的HNH与RuvC结构域分别切割目标链和非目标链。PAM序列(如SpCas9的5'-NGG-3')是靶向特异性的关键，通过PAM相互作用域触发局部DNA解旋。

DNA修复通路的博弈

DSB修复主要依赖两条竞争性通路：

1. NHEJ：Ku70/80异源二聚体快速结合断裂末端，招募DNA-PKcs和XRCC4-连接酶IV完成修复，但易产生插入/缺失突变。
2. HDR：MRN复合物启动5'端切除形成3'单链悬垂，RAD51在BRCA2协助下介导链入侵，以同源模板实现精准修复。

精准编辑的优化策略

• 促进HDR：小分子RS-1可激活RAD51，使HDR效率提升6倍；Cas9-CtIP融合蛋白直接招募切除复合物。
• 抑制NHEJ：SCR7阻断连接酶IV，而53BP1显性负突变体可局部抑制NHEJ。

疾病治疗应用

在癌症领域，CRISPR编辑的CAR-T细胞通过敲除PD-1和TGFBR2增强抗肿瘤活性。自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)中，TNFAIP3基因编辑揭示了NF-κB通路的调控机制。

挑战与突破

脱靶效应通过高保真Cas9变体(如eSpCas9)缓解；脂质纳米颗粒递送系统减少免疫原性；抗CRISPR(Acr)蛋白实现编辑窗口的时空调控。

未来展望

结合碱基编辑、单细胞多组学等新技术，CRISPR-Cas系统正推动基因治疗向更安全、更精准的方向演进。