定量透射电镜(QuTEM)技术：AAV载体表征的新标准及其在基因治疗质量控制中的应用

本研究针对腺相关病毒(AAV)载体生产中空壳/部分填充颗粒影响疗效的关键问题，开发了基于内部密度测量的定量透射电镜(QuTEM)平台。通过与沉降速度分析超速离心(SV-AUC)、质谱光度法(MP)和尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)的对比验证，证实QuTEM能精准区分完整/部分/空壳AAV颗粒，其可视化分析优势为基因治疗产品的质量控制建立了新标准。

　　

在基因治疗领域，腺相关病毒(AAV)载体因其非致病性和高效递送能力成为明星载体。然而制备过程中产生的空壳和部分填充颗粒会显著影响治疗效果，这些"无效载体"不仅降低有效剂量，还可能引发免疫反应。传统检测方法如沉降速度分析超速离心(SV-AUC)和质谱光度法(MP)虽能评估载体质量，但存在设备昂贵、耗时长或无法直观观察等局限。如何建立快速、准确且能区分部分填充颗粒的检测方法，成为制约AAV治疗产品临床转化的关键技术瓶颈。

Viralgen SL（西班牙圣塞巴斯蒂安）与QuTEM AB（瑞典斯德哥尔摩）的研究团队在《Molecular Therapy Methods》发表创新成果，开发了定量透射电镜(QuTEM)分析平台。该技术通过直接测量病毒颗粒内部电子密度，实现了对完整、部分和空壳AAV颗粒的精准区分和定量，为基因治疗产品的质量控制提供了新标准。研究团队使用自互补(scAAV)和单链(ssAAV)两种基因组构型的AAV9和AAV6载体，通过比较QuTEM与SV-AUC、MP、SEC-HPLC的检测结果，证实QuTEM具有与金标准方法高度一致的分析性能，同时保留了病毒结构的直观可视化优势。

关键技术方法包括：1)使用HEK-293细胞系统生产scAAV和ssAAV载体；2)通过碘克沙醇密度梯度离心和离子交换色谱纯化病毒；3)采用改进的透射电镜技术直接测量病毒内部密度；4)开发自动图像分析算法Gridsee进行颗粒识别和密度定量；5)应用SV-AUC、MP和SEC-HPLC进行正交验证。

生成ssAAV和scAAV载体
研究设计了4.7kb单链(ssAAV)和2kb自互补(scAAV)两种基因组构型的AAV载体，通过三重质粒转染系统在HEK-293细胞中生产。ddPCR滴度检测显示AAV9产量高于AAV6，且ssAAV构型的生产效率显著优于scAAV。碱性凝胶电泳证实scAAV中存在单体和二聚体两种基因组形式，而ssAAV仅显示单链构型。

QuTEM分析设计
该创新方法采用未染色的冷冻电镜技术，通过椭圆检测算法自动识别至少1,500个AAV颗粒。图像经背景归一化处理后，测量每个衣壳内部3.7nm范围内的平均灰度值，通过高斯曲线拟合定量不同填充状态的颗粒比例。验证实验显示该方法线性良好(R²>0.99)，与理论值的偏差<4%。

载体含量分析
QuTEM分析显示ssAAV9和ssAAV6的完整颗粒比例分别为85.5%和85.4%，而scAAV9和scAAV6则降至71.4%和75.0%。这种差异主要源于scAAV中部分填充颗粒的增加（ssAAV9=11.4% vs scAAV9=24.3%）。内部密度测量还能推算基因组长度，在scAAV样品中清晰区分出2kb（单体）和4kb（二聚体）两个群体。

SV-AUC表征
沉降分析显示完整AAV颗粒的沉降系数为102.0-107.8S，空壳颗粒为60.0-70.3S，部分填充颗粒介于84.6-88.1S之间。结果与QuTEM高度一致，证实scAAV中部分填充颗粒比例显著增加。

质谱光度分析
MP检测显示完整ssAAV颗粒分子量约5,000kDa（占比86.7%-86.0%），部分填充颗粒约4,600kDa（11.4%-15.2%），空壳颗粒约3,700kDa（≤2%）。scAAV中部分填充颗粒比例增加的趋势与QuTEM和SV-AUC结果相符。

正交方法比较
对7个AAV样品的综合分析显示，QuTEM与MP的 concordance correlation coefficient(CCC)高达0.95（完整颗粒）和0.93（部分颗粒），与SV-AUC的CCC为0.89-0.97。SEC-HPLC的260/280比值虽能反映DNA含量，但无法区分完整与部分填充颗粒。

该研究建立了首个通过ICH Q2(R2)验证的AAV载体定量电镜分析方法。QuTEM技术的创新性在于：1)直接测量衣壳内部密度，避免染色引入的假象；2)保留病毒天然结构信息，可同步评估聚集和污染物；3)检测灵敏度达3μL，适合小规模工艺开发。相比传统方法，QuTEM兼具SV-AUC的定量准确性和电镜的直观性，特别是能识别部分填充颗粒这类关键质量属性。研究还揭示scAAV构型更易产生部分填充颗粒，为优化载体设计提供重要依据。这些发现对基因治疗产品的质量控制具有里程碑意义，QuTEM有望成为AAV表征的新金标准。