C端HaloTag融合显著损害AGO2功能：对RNA沉默复合体研究的启示

本研究通过CRISPR-Cas9技术构建C端HaloTag标记的AGO2（AGO2HALO）细胞模型，首次系统评估了C端标记对AGO2蛋白功能的影响。研究发现C端融合导致AGO2与TNRC6A结合减弱、RNA切割活性丧失、核定位异常及miR-451a成熟障碍，而N端标记则保持野生型功能。该成果为RNA诱导沉默复合体（RISC）研究中的蛋白标记策略提供了关键实验依据，强调末端选择对维持AGO2功能完整性的重要性。

　　

引言

Argonaute 2（AGO2）作为microRNA诱导沉默复合体（miRISC）的核心组分，在转录后基因调控中发挥关键作用。其功能依赖于N端和C端结构域的完整性，其中C端PIWI结构域含有催化四联体（DEDH）和TNRC6A结合位点。尽管N端标记策略已被广泛应用，但C端标记对AGO2功能的影响尚未明确。本研究利用CRISPaint技术首次在人类A549细胞中构建内源性C端HaloTag融合的AGO2（AGO2^HALO），系统评估其功能变化。

材料与方法

通过CRISPaint系统在AGO2最后一个外显子插入HaloTag序列，筛选获得两个克隆（C5/C10）。采用免疫共沉淀、亚细胞分级、荧光素酶报告基因等实验验证蛋白互作、定位及沉默功能。对比构建的N端EGFP-AGO2与C端AGO2-EGFP质粒，在AGO2^-/-细胞中评估沉默效率。

结果

1. 细胞增殖与RISC组分表达
AGO2^HALO细胞增殖速率与野生型无显著差异，但显示AGO4表达上调（可能为功能补偿）。免疫共沉淀揭示AGO2^HALO与TNRC6A结合减少50%，而与Dicer结合增强，提示PIWI结构域构象改变。

2. 切割与沉默功能缺陷
成熟miR-451a（依赖AGO2切割）水平下降60%，荧光素酶报告实验显示AGO2^HALO完全丧失esiRNA介导的基因沉默能力，表型与AGO2^-/-细胞相当。N端EGFP标记的AGO2则保留野生型沉默活性。

3. 亚细胞定位异常
核质分级显示AGO2^HALO几乎不进入细胞核，而N端标记蛋白保持核定位。共聚焦显微镜观察到C端标记AGO2-EGFP呈弥散胞质分布，而N端EGFP-AGO2形成类似P-body的焦点结构。

4. 结构生物学解释
AlphaFold3预测显示HaloTag从AGO2 miRNA结合槽延伸（图5），可能阻碍RNA结合。C端残基A859（溶剂可及表面积仅20%）通常与miRNA磷酸基团形成氢键网络，标记导致该关键相互作用破坏。

讨论

本研究揭示C端标记通过三重机制损害AGO2功能：
1）空间位阻直接干扰PIWI域催化中心；
2）破坏C端残基与miRNA的分子互作；
3）阻碍核定位信号识别。相较之下，N端因天然柔性且远离功能域，更适合标记。

该发现为RISC研究提供重要方法论警示：

• 需通过正交实验（如miR-451a检测、报告基因等）全面验证标记蛋白功能
• 推荐优先选择N端标记策略
• 强调AlphaFold等计算工具在标记设计中的指导价值

结论

C端HaloTag或EGFP融合导致AGO2功能严重受损，不适用于RISC生物学研究。未来工作应聚焦开发最小化干扰的N端标记系统，并结合冷冻电镜等结构生物学手段解析标记蛋白的构象变化。