光控二元相互作用工具PhoBITs的工程化设计及其在生物医学中的应用

本研究针对现有光遗传学工具在模块化设计和蛋白功能操控上的局限性，开发了基于细菌降解系统ssrA-sspB的光诱导二元相互作用工具PhoBITs。研究团队通过将LOV2和CRY2光敏结构域与优化后的ssrA/sspB配对结合，构建了光关闭型(PhoBIT1)和光开启型(PhoBIT2)双系统，实现了对GPCR信号、钙通道、坏死性凋亡和先天免疫通路的精准光控。该成果发表于《Nature Communications》，为复杂生物学过程的时空解析提供了新型工具，并为肿瘤光遗传学治疗提供了概念验证。

　　

在生命科学领域，如何实现对蛋白质功能的精准时空调控一直是重大挑战。传统光遗传学工具如LOVTRAP、iLID等虽已广泛应用，但其较大的分子尺寸常干扰宿主蛋白功能，且缺乏模块化设计灵活性。来自德州农工大学健康科学中心的研究团队另辟蹊径，从大肠杆菌蛋白降解机器中发掘出仅含7个氨基酸的ssrA肽段及其结合伴侣sspB，通过创新性工程改造，开发出具有双向调控能力的光诱导二元相互作用工具PhoBITs，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究主要采用四种关键技术：1）基于深度突变扫描的ssrA/sspB亲和力优化；2）LOV2和CRY2光敏结构域的多位点融合策略；3）整合线粒体定位报告系统和BRET（生物发光共振能量转移）技术的相互作用筛选平台；4）SCID小鼠白血病移植模型验证治疗潜力。

Engineering of LOV2-based PhoBIT1
研究人员首先在sspB的loop区插入LOV2光敏结构域，通过线粒体共定位实验筛选出最佳插入位点S5，开发出光关闭型系统PhoBIT1。该系统在黑暗状态下保持ssrA结合，蓝光照射后8.5秒内快速解离，28.1秒内重新结合。将其应用于CRISPRi系统时，成功实现了基因表达的光控可逆调节，EGFP表达量可产生60%的动态变化。

PhoBIT1 enables optical control of GPCR activation
通过将ssrA标签融合到蛋白酶激活受体(PAR)的N端，团队构建了"光笼化"的optoPAR系统。在表面展示sspB(LOV2)-TM的细胞中，蓝光刺激使PAR4-Tango报告基因表达提升5.7倍，并通过NEMO钙指示剂证实了Ga_q-PLCβ信号通路的激活。与LOVTRAP系统相比，ssrA的小尺寸优势避免了Zdk1融合导致的受体激活障碍。

Engineering of CRY2-based PhoBIT2
通过140种ssrA突变体的深度筛选，研究人员获得低背景结合的ssrA-A2C/A2W变体。将CRY2与sspB-A56F变体融合后，光诱导结合能力提升9.9倍，创建了光开启型PhoBIT2系统。该系统在黑暗状态下几乎无自发结合，显著优于传统CRY2olig/CIB1二聚化系统。

Optogenetic manipulation of Ca²⁺ channel activation by PhoBIT2
将ssrA2插入STIM1_ct的685位点（多碱基尾端）后，光诱导的CRY2-sspB2寡聚化成功激活ORAI通道，引发钙内流（半衰期0.4分钟），并驱动NFAT核转位。在Jurkat细胞中，该体系可诱导内源性IL-2 mRNA表达和分泌，证实了生理相关性。

PhoBIT2 as an ON-switch for light-induced necroptosis
将ssrA2插入MLKL-NT（1-140）与mCherry之间构建的A2变体，在蓝光刺激下6分钟内即引发Annexin V阳性的坏死性凋亡，其效率与经典工具LiPOP1相当。该实验首次实现了程序性细胞死亡的光控精确诱导。

Light-inducible STING activation driven by PhoBIT2
当ssrA2同时标记cSTING（152-379）的N端和C端时，光诱导的STING寡聚化可显著激活TBK1-IRF3磷酸化级联反应，促进IFN-β分泌。这种人工调控模式为研究先天免疫提供了新范式。

PhoBIT2 allows light-inducible monobody-target recognition
在靶向BCR-ABL致癌蛋白的HA4-7c12单链抗体中插入ssrA2后，光控结合使K562细胞的Y412磷酸化水平显著降低。在SCID小鼠模型中，每日光照使肿瘤体积减少67%，验证了其治疗潜力。

这项研究通过精巧的分子设计，将微型ssrA标签的模块化优势与光遗传学控制完美结合。PhoBIT系统不仅克服了传统工具的体积限制，其低于0.6的暗态背景信号和最高9.9倍的光诱导动态范围，为活细胞研究设立了新标准。特别是在肿瘤治疗方面，该技术首次实现了单链抗体功能的远程光控，为克服TKI耐药提供了新思路。研究者特别指出，未来通过整合UVR8-COP1或PhyB-PIF等多波长系统，可进一步拓展该平台的适用范围，实现更复杂的生物学过程操控。